一种眼镜王蛇抗菌肽抑制酶解的方法技术

本发明专利技术提供一种眼镜王蛇抗菌肽抑制酶解的方法，具体为将眼镜王蛇抗菌肽表达液上清样品pH调到12.0，室温处理2h，然后将PH回调至7.0置于

【技术实现步骤摘要】
一种眼镜王蛇抗菌肽抑制酶解的方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种眼镜王蛇抗菌肽抑制酶解的方法。

技术介绍

[0002]cathelicidins是一种在先天免疫系统中发挥重要作用的阳离子宿主防御肽，眼镜王蛇抗菌肽为cathelicidins的截短肽，由30个氨基酸序列组成，目前研究发现其对大肠杆菌（Escherichia coli）、铜绿假单胞菌（Pseudomona aeruginosa ）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)等多种革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均具有较好的抑菌效果。
[0003]目前在眼镜王蛇抗菌肽发酵工程制备过程中，发现眼镜王蛇抗菌肽易被发酵液中残留的蛋白酶降解，降低或失去生物活性，导致眼镜王蛇抗菌肽无法稳定长期保存，因此保护眼镜王蛇抗菌肽免于被蛋白酶降解，使眼镜王蛇抗菌肽溶液长期、稳定保存是眼镜王蛇抗菌肽生产制备过程中亟需解决的技术问题。

技术实现思路

[0004]为解决上述问题，现提出一种眼镜王蛇抗菌肽抑制酶解的方法，通过强碱处理法使发酵上清液中残留的蛋白酶空间结构破坏，失去降解眼镜王蛇抗菌肽的功能活性，达到眼镜王蛇抗菌肽长期、稳定保存的目的。
[0005] （1）对眼镜王蛇抗菌肽进行碱处理：将眼镜王蛇抗菌肽表达液上清样品pH调到7.0
‑
12.0，室温处理2h，然后将PH回调至7.0置于
‑
20℃保存即可。
[0006] （2）对眼镜王蛇抗菌肽样品抑菌活性进行测定：挑取嗜水气单胞菌、铜绿假单胞菌、蜡样芽孢杆菌及金黄色葡萄球菌4种致病指示菌的单菌落，接种于LB液体培养基中摇培至菌液OD600值为0.4
±
0.02，再将4种病原菌菌液按1：500的比例添加至新制备的LB液体培养基中，混合均匀后，按每孔100μL的量加入酶标孔中，同时加入100μL经强碱处理的眼镜王蛇抗菌肽表达液上清样品。以100μL/孔 蛋白酶处理2h的眼镜王蛇抗菌肽表达液上清精品为阴性对照。37℃过夜培养16h后，使用酶标仪测定数值。
[0007]优选的，所述步骤（1）对眼镜王蛇抗菌肽进行强碱处理中，具体为将眼镜王蛇抗菌肽表达液上清，pH调到12.0，室温处理2h后，将pH回调至7.0置于
‑
20℃保存备用。
[0008] 优选的，所述步骤（2）中LB液体培养基的制备方法：取胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g摇动容器直至溶质溶解;用5mol/L NaOH调pH至7.0用去离子水定容至1L，121℃高压下蒸汽灭菌20min后冷却备用。
[0009]本专利技术通过强碱处理方法后得到眼镜王蛇抗菌肽表达液上清明显提高对铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、嗜水气单胞菌及蜡样芽孢杆菌的抑制效果，又可使蛋白酶完全失活，防止表达液中眼镜王蛇抗菌肽受到酶解而失活，能够达到眼镜王蛇抗菌肽长期稳定保
存的目的。
附图说明
[0010]图1为强碱处理后的眼镜王蛇抗菌肽液相色谱图。
[0011]图2为不同碱处理抑制蛋白酶水解的眼镜王蛇抗菌肽上清抑菌效果。
具体实施方式
[0012]下面结合实施例及附图对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限于此。
[0013]实验试剂和材料1.培养基：LB培养基：胰蛋白胨，酵母浸膏，氯化钠以及固体培养基所需琼脂粉均购自国药集团。
[0014] 2. 细菌菌株购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。
[0015]除非特别指明，本专利技术以下实施例所用的试剂均为分析纯试剂，且可从常规渠道商购获得。
[0016] （1）对眼镜王蛇抗菌肽进行碱处理：样品处理：经 12000 r/min 离心 2 min 后，再用 0.22
ꢀµ
m 过滤器过滤获得眼镜王蛇抗菌肽表达液上清，将眼镜王蛇抗菌肽表达液上清分为5份，pH分别调到8.0、9.0、10.0、11.0、12.0，5份不同pH值的上清液分别室温处理2h后将pH回调至7置于
‑
20℃保存备用。
[0017] （2）对5份碱处理后的眼镜王蛇抗菌肽样品抑菌活性进行测定：
①
LB培养基的配制与灭菌：称取胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g摇动容器直至溶质溶解；用5mol/L NaOH调pH至7.0用去离子水定容至1L.，121℃高压下蒸汽灭菌20min后冷却备用。
[0018]ꢀ②
4种病原菌的摇培与浓度标定：挑取新鲜活化的嗜水气单胞菌、铜绿假单胞菌、蜡样芽孢杆菌及金黄色葡萄球菌平板上的单菌落，接种于LB液体培养基中，37℃黑暗条件下摇培12
‑
14h备用。
[0019] 采用紫外分光光度计在600nm波长处测定4种病原菌浓度并使用LB液体培养基将菌液浓度OD600 值标定至0.4
±
0.02。
[0020]ꢀ③
强碱处理样品液体抑菌试验：将上述 OD600值为0.4
±
0.02的病原菌菌液按1：500的比例添加至LB液体培养基，混合均匀后加入酶标孔中，每孔100μL，同时加入5份不同pH处理的眼镜王蛇抗菌肽表达液上清样品各100μL，每种样品再设置3个平行样品。以100μL/孔 蛋白酶处理2h的眼镜王蛇抗菌肽表达液上清为阴性对照。37℃过夜培养16h，使用酶标仪测定数值，结果如图2的表1。
[0021] （3）强碱处理样品活性测定结果：经液体抑菌试验表明将眼镜王蛇抗菌肽表达液上清pH调到12.0，室温处理2h 后所得眼镜王蛇抗菌肽表达液上清对铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、嗜水气单胞菌及蜡样芽孢杆菌抑制效果最佳，同时液相检测也显示该条件下眼镜王蛇抗菌肽表达液上清内目标产物未被破坏，表明该条件下既可完全保持眼镜王蛇抗菌肽的抑菌活性，又可使蛋白酶完
全失活，防止表达液中酶类发生酶解眼镜王蛇抗菌肽，使眼镜王蛇抗菌肽失活。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种眼镜王蛇抗菌肽抑制酶解的方法，其步骤在于：（1）对眼镜王蛇抗菌肽进行碱处理：将眼镜王蛇抗菌肽表达液上清样品pH调到7.0
‑
12.0，室温处理2h，然后将PH回调至7.0置于
‑
20℃保存即可；（2）对眼镜王蛇抗菌肽样品抑菌活性进行测定：挑取嗜水气单胞菌、铜绿假单胞菌、蜡样芽孢杆菌及金黄色葡萄球菌4种致病指示菌的单菌落，接种于LB液体培养基中摇培至菌液值为0.4
±
0.02，再将4种病原菌菌液按1：500的比例添加至新制备的LB液体培养基中，混合均匀后，按每孔100μL的量加入酶标孔中，同时加入100μL经强碱处理的眼镜王蛇抗菌肽表达液上清样品；以1...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈李元，朱新鹏，卢玉平，龚婷婷，钱晓明，
申请(专利权)人：江苏亢钧生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：