一种腹斑倭蛙抗菌肽Nv-CATH及其基因和应用制造技术

本发明专利技术涉及一种腹斑倭蛙抗菌肽Nv

【技术实现步骤摘要】
一种腹斑倭蛙抗菌肽Nv
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CATH及其基因和应用


[0001]本专利技术涉及一种腹斑倭蛙(Nanorana ventripunctata)抗菌肽Nv
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CATH及其基因和应用，属于生物医学领域。

技术介绍

[0002]近年来的研究表明，抗菌肽是所有动物、植物和微生物防御系统中的一个重要组成部分。它们是机体为抵御病原微生物侵袭而产生的一类小分子活性多肽，具有分子量小、稳定性好、杀菌迅速和不易产生耐药性等特点。这些特性使得抗菌肽具有非常广阔的运用前景，有望替代目前临床上易于产生耐药性的传统抗生素药物。抗菌肽不易产生耐药性的原因是，其杀菌机理与传统抗生素不同。它们主要是作用于细菌的细胞膜,破坏其稳定性，进而细胞膜渗透性发生改变，使得内容物外泄导致细胞死亡。不同物种来源或同一物种中抗菌肽的结构形式和生物活性差别较大。国内外研究人员一直致力于从不同物种中发掘结构新颖的抗菌肽，直接利用或者以其为模板进行分子改造。目前，已有抗菌肽用于海产品保鲜和动物饲料添加剂中。结合生态环境从各种自然资源中发掘具有潜在药用价值的抗菌肽是目前多肽新药研究的一个热点。
[0003]两栖动物是抗菌肽资源发掘中最重要的一类资源，其皮肤裸露，为抵御环境中各种微生物的侵袭，它们能够分泌多种分子结构新颖、功能复杂多样的的抗菌肽。这些活性多肽广泛参与机体的各种生理活动，具有各种药理活性，如抗微生物、抗肿瘤、抗氧化、免疫调节、创伤修复、镇痛等作用。腹斑倭蛙常栖息于海拔高、昼夜温差大的高原沼泽地区，这意味着随着适应性的发展，腹斑倭蛙必然已经形成了一套有效的免疫防御系统来抵御恶劣生存环境中微生物的侵袭。腹斑倭蛙(Nanorana ventripunctata)为两栖纲无尾目蛙科倭蛙属的两栖动物，为中国特有物种，其皮肤中cathelicidin家族的强效抗菌肽尚无报道。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种新的具有强效广谱抗微生物活性(包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌)的腹斑倭蛙抗菌肽及其基因和应用。
[0005]本专利技术的抗菌肽Nv
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CATH是中国两栖类特有物种腹斑倭蛙防御肽基因编码的一种环状多肽，分子量3356.98道尔顿，等电点11.56，多肽全序列一级结构(氨基酸序列SEQ ID NO:1)为：
[0006][0007](NCNFLCKVKQRLRSVSSTSHIGMAIPRPRG)，其第2位半胱氨酸和第6位半胱氨酸组成一对分子内二硫键形成环状多肽。
[0008]编码该腹斑倭蛙抗菌肽Nv
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CATH前体的基因(GenBank accession No.OP264074)
由714个核苷酸序列组成，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，其自5
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端至3
’
端序列为：
[0009][0010]其中，第373
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522位核苷酸为成熟腹斑倭蛙抗菌肽Nv
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CATH的编码基因。
[0011]本专利技术的腹斑倭蛙抗菌肽Nv
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CATH在制备用于治疗溶血性葡萄球菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、琼氏不动杆菌和/或甲型副伤寒杆菌所引起的感染疾病的药物中的应用。
[0012]本专利技术的有益效果在于：
[0013]本专利技术提供了一种新的具有广谱抗微生物活性(包括革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌)的腹斑倭蛙抗菌肽Nv
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CATH，本专利技术对溶血性葡萄球菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、琼氏不动杆菌和甲型副伤寒杆菌引起的感染疾病具有显著的抑制细菌生长的作用。
附图说明
[0014]图1为Nv
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CATH的细菌杀伤动力学曲线，图中：在37℃下，测定浓度为4
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MIC的Nv
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CATH对(A)S.aureus ATCC25923，(B)A.junii 13A15578，(C)K.pneumoniae 0813343，(D)S.paratyphi A，(E)E.faecalis ATCC29212，(F)S.haemolyticus 13A13770在0、1、2、4、6、8和12h的杀灭情况；数据为三个独立实验的平均值。
具体实施方式
[0015]下面结合附图对本专利技术作详细说明。
[0016]一、腹斑倭蛙抗菌肽Nv
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CATH基因的克隆和氨基酸序列测定
[0017]1、腹斑倭蛙皮肤总RNA提取
[0018]活体腹斑倭蛙用水清洗干净，放入液氮中速冻10小时，取300mg皮肤组织，加入3ml Trizol溶液，于20ml玻璃匀浆器中匀浆30分钟。加入等体积酚/氯仿溶液，剧烈混匀，室温放置10分钟，4℃，12000rpm离心10分钟，弃除沉淀。上清加入等体积的异丙醇，室温放置10分
钟，4℃，12000rpm离心10分钟，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即为腹斑倭蛙皮肤总RNA。
[0019]2、腹斑倭蛙皮肤mRNA的纯化：mRNA分离纯化采用美国PROMEGA公司的mRNA Isolation Systems试剂盒
[0020]提取的腹斑倭蛙皮肤总RNA溶于500μl DEPC水中，放入65℃水浴10分钟，加入3μl的Oligo(dT)探针和13μl 20
×
SSC溶液，混匀后放置室温冷却，称为A液。将磁珠(SA
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PMP)轻弹混匀，至磁力架吸附30秒，弃上清，加0.5
×
SSC 0.3m1，至磁力架吸附30秒，最后加0.1ml 0.5
×
SSC悬浮，称之为B液。将A液加入B液中，室温放置10分钟，至磁力架吸附30秒，弃上清，用0.1
×
SSC洗涤4次，最后弃上清，加0.1ml DEPC水悬浮，至磁力架上吸附30秒，将上清移至新的试管，再加入0.15m1 DEPC水重新悬浮，至磁力架吸附30秒，移上清至上述试管，则上清中为纯化的腹斑倭蛙皮肤mRNA。加入1/10体积3M乙酸钠，pH5.2，等体积异丙醇，于
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70℃放置30分钟，4℃，12000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀溶解于10μl DEPC水中。
[0021]3、腹斑倭蛙皮肤cDNA文库构建
[0022]采用CLONTECH公司Creator
TM SMART TM cDNA Library Construction Kit质粒cDNA文库构建试剂盒。
[0023](a)cDNA第一链合成(mRNA反转录)
[0024]在0.5ml无菌的离心管加入1μl腹斑倭蛙皮肤mRNA、1μl SMART IV寡聚核苷酸、1μl CDS III/3
’
PCR引物，加2μl去离子水使总体积达到5μl。混匀离心管中的试剂并以12000rpm离心15秒，72℃保温2分钟。将离心管在冰本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种腹斑倭蛙抗菌肽Nv
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CATH，其特征在于，该抗菌肽是中国两栖类特有物种腹斑倭蛙防御肽基因编码的一种由第2位半胱氨酸和第6位半胱氨酸组成一对分子内二硫键形成的环状多肽，分子量3356.98道尔顿，等电点11.56，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示。2.编码腹斑倭蛙抗菌肽Nv
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CATH前体的基因，其特征在于，该前体基因GenBank accession No...

【专利技术属性】
技术研发人员：木丽仙，武静，杨海龙，石洁，刘彤，杨媛，
申请(专利权)人：昆明医科大学，
类型：发明
国别省市：