一种衍生肽KR-23及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供一种衍生肽KR

【技术实现步骤摘要】
一种衍生肽KR
‑
23及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种衍生肽KR
‑
23及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]饲料全面禁抗，给畜牧业带来养殖与医疗双重成本的增加，因此，亟需寻找新型绿色、安全、高效的抗生素替代品。
[0003]抗菌肽与抗生素具有不同的抑菌机制，前者以“温和式”干扰多种生物性功能的发挥，而非高度特异性作用靶位点使其丧失功能，而后者倾向作用于菌体单一靶点。抗菌肽在动物体内无残留，对环境无污染，符合畜产品安全生产的需要，适合在饲料生产过程中使用，具有作为新一代绿色饲料添加剂的潜质。目前，对抗菌肽的开发与应用已经在畜牧生产和医药卫生领域广泛开展。
[0004]但与传统抗生素相比，天然抗菌肽与生产应用还存在差距，细胞毒性高的问题不容忽视。因此人工设计抗菌肽或分子改造已有天然抗菌肽是高效抗菌制剂发展的有效途径之一。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种衍生肽KR
‑
23及其制备方法和应用；此衍生肽KR
‑
23治疗指数高。
[0006]本专利技术的目的通过如下技术实现：一种衍生肽KR
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23，序列如序列表SEQ ID No.1所示。
[0007]如上所述的一种衍生肽KR
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23，制备方法如下：（1）针对高溶血性的蛙源抗菌肽AR
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23(即为AR
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23)，通过Lys分别替换Ala1、Ala8和Ile17，通过Ile2与Lys11位置互换和Ｃ末端酰胺化而生成衍生肽KR
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23，序列如序列表SEQ ID No.1所示；（2）采用固相化学合成法通过多肽合成仪得到肽树脂，将得到的肽树脂经过TFA切割后，得到衍生肽KR
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23；（3）经过反相高效液相色谱纯化后，即完成衍生肽KR
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23的制备。
[0008]如上所述的一种衍生肽KR
‑
23的应用，在制备治疗革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌感染性疾病药物中的应用。
[0009]通过本方法制备的衍生肽KR
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23的实验技术简单，对得到的衍生肽KR
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23进行抗菌和溶血活性检测，发现衍生肽KR
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23（即为KR
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23）具有广谱抗菌作用，而且具有极低的溶血活性。综上所述，KR
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23是一种具有较高应用价值的抗菌肽。
附图说明
[0010]图1为AR
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23和KR
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23的螺旋轮图。
[0011]图2为KR
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23的氨基酸序列。
[0012]图3为AR
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23和KR
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23的抑菌活性。
[0013]图4为AR
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23和KR
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23的溶血活性及治疗指数。
具体实施方式
[0014]下面结合实施例及附图对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限于此。
[0015]实施例1：一种衍生肽KR
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23，序列如序列表SEQ ID No.1所示。
[0016]该衍生肽KR
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23的设计：针对高溶血性的蛙源抗菌肽AR
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23，用Lys分别替换AR
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23序列中Ala1、Ala8和Ile17，以增加带正荷氨基酸的比例，降低肽的疏水性；Ile2与Lys11在序列中位置互换，以破坏肽的α
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螺旋的双亲性结构，如附图1所示；Ｃ末端酰胺化以增加肽的稳定性而生成衍生肽KR
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23，序列如附图2所示。
[0017]实施例2：一种衍生肽KR
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23的制备方法，采用固相化学合成法合成衍生肽KR
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23。
[0018]1、衍生肽KR
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23的制备从C端到N端逐一进行，通过多肽合成仪来完成。首先将Fmoc
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X(X是每个抗菌肽的C端第一个氨基酸)接入到Wang树脂，然后脱去Fmoc基团后得到X
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Wang树脂；再将Fmoc
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Y
‑
Trt
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OH(9
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芴甲氧羧基
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三甲基
‑
Y，Y为每个抗菌肽C端第二个氨基酸)；按照这个程序依次从C端合成到N端，直至合成完毕，得到脱去Fmoc基团的侧链保护的树脂；2、在上述得到的肽树脂中，加入切割试剂，20℃避光下反应2h，过滤；沉淀TFA(三氟乙酸)洗涤，将洗液与上述滤液混合，旋转蒸发仪浓缩，再加入10倍左右体积的预冷无水乙醚，
‑
20℃沉淀3h，析出白色粉末物，以2500g离心10min，收集沉淀，再用无水乙醚洗涤沉淀，真空干燥，得到多肽，其中切割试剂由TFA、水和TIS（三异丙基氯硅烷）按照质量比95:2.5:2.5混合而成；3、使用0.2mol/L硫酸钠（磷酸调节至pH7.5）进行柱平衡30min，用90%乙腈水溶液溶解多肽，过滤，C18反相常压柱，采用梯度洗脱（洗脱剂为甲醇和硫酸钠水溶液按照体积比为30:70~70:30混合），流速为1mL/min，检测波为220nm，收集主峰，冻干；再利用反相C18柱进一步纯化，洗脱液Ａ为0.1%TFA/乙腈溶液；洗脱液Ｂ为0.1%TFA/水溶液，洗脱浓度为50％~90%，洗脱时间为30min，流速为1mL/min，再同上收集主峰，冻干，即得纯化衍生肽KR
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23；4、衍生肽KR
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23的鉴定：将上述得到的衍生肽KR
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23经过电喷雾质谱法分析，理论分子量与实测分子量基本一致，衍生肽KR
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23的纯度大于95%。
[0019]实施例3：一种衍生肽KR
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23的应用，在制备治疗革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌感染性疾病药物中的应用。
[0020]该衍生肽KR
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23在应用中生物活性的测定。
[0021]1、抗菌活性的测定：将衍生肽KR
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23配置成浓度为2.56mM储存液以备使用。利用微量肉汤稀释法测定KR
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23和AR
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23的最小抑菌浓度。以0.01%乙酸（含0.2%BSA）作为稀释液，使用二倍稀释法依次配置系列梯度的KR
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23和AR
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23溶液。取上述溶液100μL置于96孔细胞培养板中，然后分别添加等体积的待测菌液（~105个/mL）于各孔中。分别设置阳性对照（含有菌液而不含有KR
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23和AR
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23）和阴性对照（既不含菌液也不含KR
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23和AR...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种衍生肽KR
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23，其特征在于：序列如序列表SEQ ID No.1所示。2.如上所述的一种衍生肽KR
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23的制备方法，其特征在于：制备方法如下：（1）针对高溶血性的蛙源抗菌肽AR
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23，通过Lys分别替换Ala1、Ala8和Ile17，通过Ile2与Lys11位置互换和Ｃ末端酰胺化而生成衍生肽KR
‑
23...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈建，李伟忠，张良红，薛佳桢，高峰涛，
申请(专利权)人：陈建，
类型：发明
国别省市：