一种衍生肽P2FA及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供一种衍生肽P2FA及其制备方法和应用，衍生肽P2FA的序列如SEQ ID No.1所示。本发明专利技术以虾源抗菌肽为原料，截取形成螺旋结构(32

【技术实现步骤摘要】
一种衍生肽P2FA及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种衍生肽P2FA及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]饲料全面禁抗，给畜牧业带来养殖与医疗双重成本的增加，因此，亟需寻找新型绿色、安全、高效的抗生素替代品。
[0003]抗菌肽与抗生素具有不同的抑菌机制，前者以“温和式”干扰多种生物性功能的发挥，而非高度特异性作用靶位点使其丧失功能，而后者倾向作用于菌体单一靶点。并且抗菌肽在动物体内无残留，对环境无污染，符合畜产品安全生产的需要，适合在饲料生产过程中使用，具有作为新一代绿色饲料添加剂的潜质。目前，对抗菌肽的开发与应用已经在畜牧生产和医药卫生领域广泛开展。
[0004]但与传统抗生素相比，天然抗菌肽与生产应用还存在差距，活性低、细胞毒性高、生产成本高等三种缺陷不容忽视。因此人工设计抗菌肽或分子改造已有天然抗菌肽是高效抗菌制剂发展的有效途径之一。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种衍生肽P2FA及其制备方法和应用；此衍生肽P2FA治疗指数高。
[0006]本专利技术的目的通过如下技术实现：一种衍生肽P2FA，序列如序列表SEQ ID No.1所示。
[0007]如上所述的一种衍生肽P2FA，制备方法如下：（1）以虾源抗菌肽为原料，通过截取形成螺旋结构(32
‑
42)的11个氨基酸、Arg残基分别替换Ser32和Asp33残基、Phe残基替换Cys38残基、Ala残基替换Cys39残基及Ｃ末端酰胺化而生成衍生肽P2FA，序列如SEQ No.1所示；（2）采用固相化学合成法通过多肽合成仪得到肽树脂，将得到的肽树脂经过TFA切割后，得到衍生肽P2FA；（3）经过反相高效液相色谱纯化后，即完成衍生肽P2FA的制备。
[0008]如上所述的一种衍生肽P2FA的应用，在制备治疗革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌感染性疾病药物中的应用。
[0009]通过本方法制备的衍生肽P2FA的实验技术简单，对得到的衍生肽P2FA进行抗菌和溶血活性检测，衍生肽P2FA对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌有明显的抑制作用，而且具有极低的溶血活性。综上所述，衍生肽P2FA是一种具有较高应用价值的抗菌肽。
附图说明
[0010]图1为PEN2二级结构预测。
[0011]图2为衍生肽P2FA的氨基酸序列。
[0012]图3为衍生肽P2FA的抑菌活性。
[0013]图4为衍生肽P2FA溶血活性及治疗指数。
具体实施方式
[0014]下面结合实施例及附图对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限于此。
[0015]实施例1：一种衍生肽P2FA，序列如序列表SEQ ID No.1所示。
[0016]该衍生肽P2FA的设计：以虾源抗菌肽PEN2(即PEN2)为原料，通过二级结构预测，如附图1所示，截取形成螺旋结构(32
‑
42)的11个氨基酸序列，Arg残基分别替换Ser32和Asp33残基以增加碱性氨基酸比例而提高抗菌肽活性，Phe残基替换Cys38和Ala残基替换Cys39以增加肽疏水性和维持螺旋结构，Ｃ末端酰胺化以稳定肽结构而生成衍生肽P2FA(即P2FA)，序列如附图2所示。
[0017]通过上述设计将PEN2的长度50个氨基酸缩短至11个氨基酸(图2)，P2FA降低了氨基酸的使用量，与PEN2相比，合成P2FA成本明显降低，适合生产应用。
[0018]实施例2：一种衍生肽P2FA的制备方法，采用固相化学合成法合成衍生肽P2FA。
[0019]1、衍生肽P2FA的制备从C端到N端逐一进行，通过多肽合成仪来完成。首先将Fmoc
‑
X(X是每个抗菌肽的C端第一个氨基酸)接入到Wang树脂，然后脱去Fmoc基团后得到X
‑
Wang树脂；再将Fmoc
‑
Y
‑
Trt
‑
OH(9
‑
芴甲氧羧基
‑
三甲基
‑
Y，Y为每个抗菌肽C端第二个氨基酸)；按照这个程序依次从C端合成到N端，直至合成完毕，得到脱去Fmoc基团的侧链保护的树脂；2、在上述得到的肽树脂中，加入切割试剂，20℃避光下反应2h，过滤；沉淀TFA(三氟乙酸)洗涤，将洗液与上述滤液混合，旋转蒸发仪浓缩，再加入10倍左右体积的预冷无水乙醚，
‑
20℃沉淀3h，析出白色粉末物，以2500g离心10min，收集沉淀，再用无水乙醚洗涤沉淀，真空干燥，得到多肽，其中切割试剂由TFA、水和TIS（三异丙基氯硅烷）按照质量比95:2.5:2.5混合而成；3、使用0.2mol/L硫酸钠（磷酸调节至pH7.5）进行柱平衡30min，用90%乙腈水溶液溶解多肽，过滤，C18反相常压柱，采用梯度洗脱（洗脱剂为甲醇和硫酸钠水溶液按照体积比为30:70~70:30混合），流速为1mL/min，检测波为220nm，收集主峰，冻干；再利用反相C18柱进一步纯化，洗脱液Ａ为0.1%TFA/乙腈溶液；洗脱液Ｂ为0.1%TFA/水溶液，洗脱浓度为50％~90%，洗脱时间为30min，流速为1mL/min，再同上收集主峰，冻干，得到纯化衍生肽P2FA；4、衍生肽P2FA的鉴定：将上述得到的P2FA经过电喷雾质谱法分析，理论分子量与实测分子量基本一致，P2FA的纯度大于95%。
[0020]实施例3：一种衍生肽P2FA的应用，在制备治疗革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌感染性疾病药物中的应用。
[0021]该衍生肽P2FA在应用中生物活性的测定。
[0022]1、抗菌活性的测定：将P2FA配置成为浓度为2.56mM储存液以备使用。利用微量肉汤稀释法测定P2FA和蜂毒素的最小抑菌浓度。以0.01%乙酸（含0.2%BSA）作为稀释液，使用二倍稀释法依次配置系列梯度的P2FA和蜂毒素溶液。取上述溶液100μL置于96孔细胞培养板中，然后分别添加等体积的待测菌液（~105个/mL）于各孔中。分别设置阳性对照（含有菌液而不含有P2FA或蜂毒素）和阴性对照（既不含菌液也不含P2FA或蜂毒素）。37℃恒温培养
20h，以肉眼未见孔底部有混浊现象的即为最小抑菌浓度。
[0023]结果如附图3所示，P2FA对于革兰氏阴性和阳性菌表现出不同程度的抑菌活性，与蜂毒素（ME26）相比，P2FA抑菌活性略高于ME26，说明P2FA的设计获得成功，具有高抗菌活性。
[0024]2、溶血活性的测定：采集人的新鲜血液1mL，肝素抗凝后溶解到2mL的PBS溶液中，1000g离心5min，收集红细胞；用PBS洗涤3遍，再用10mL的PBS重悬；取50
µ
L红细胞悬液与50
µ
L用PBS溶解的不同浓度的P2FA和ME26溶液混合均匀，在37℃培养箱内恒温孵育1h；后取出，4℃、1000g离心5min；取出上清液用酶标仪在570nm处测光吸收值；每组取平本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种衍生肽P2FA，其特征在于：序列如SEQIDNo.1所示。2.如上所述的一种衍生肽P2FA，其特征在于：制备方法如下：（1）以虾源抗菌肽为原料，通过截取形成螺旋结构(32
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42)的11个氨基酸、Arg残基分别替换Ser32和Asp33残基、Phe残基替换Cys38残基、Ala残基替换Cys39残基及Ｃ末端...

【专利技术属性】
技术研发人员：李伟忠，陈建，张良红，薛佳桢，封佳丽，
申请(专利权)人：陈建，
类型：发明
国别省市：