牙鲆黏蛋白Muc2特异性抗体制备及应用制造技术

本发明专利技术提供一种牙鲆黏蛋白Muc2的特异性抗体及其应用，所提供的抗Muc2特异性抗体可用于检测牙鲆黏蛋白Muc2及其阳性黏液细胞，为进一步了解黏液细胞在牙鲆黏膜免疫应答中的作用提供了有力支撑。本发明专利技术筛选获得了牙鲆黏蛋白Muc2基因的B细胞抗原表位VYRQDRSECTCLE，偶联KLH后免疫Balb/c小鼠，从而制备了牙鲆Muc2特异性抗体，为检测牙鲆Muc2蛋白分子及其阳性黏液细胞创造了关键工具。黏液细胞创造了关键工具。黏液细胞创造了关键工具。

【技术实现步骤摘要】
牙鲆黏蛋白Muc2特异性抗体制备及应用


[0001]本专利技术属于鱼类分子免疫学
，具体涉及一种牙鲆(Paralichthys olivaceus)黏蛋白Muc2的特异性抗体及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]鱼类的黏膜系统作为一种古老而复杂的免疫防线，时刻受到外界的物理、化学与微生物刺激。其中鱼类鳃、肠和皮肤等部位的黏液细胞所分泌的黏液可提供润滑、细胞信号通路及化学屏障的功能。黏液形成致密的网状结构覆盖在上皮层，其中富含的抗菌肽、抗体、凝集素等免疫因子可有效抑制黏膜病原微生物的繁殖与侵染，黏液层不断更新代谢，规律性地将病原排出体外。相比于陆生动物，鱼类的体表黏液在黏膜免疫防御中具有更重要的意义。
[0003]黏蛋白是黏液的主要组成成分，分为跨膜型黏蛋白和胶形成型黏蛋白。Muc2是一种典型的胶形成型黏蛋白，其由黏液细胞分泌后体积迅速扩大，成为具有网格结构的胶状骨架，天然免疫因子可透过网状间隙作用于黏蛋白糖链上附着的病原菌。因此，黏蛋白Muc2对于维持黏膜稳态至关重要。目前，已获得了人类、小鼠等多种高等脊椎动物Muc2特异性抗体，以其为研究工具扩展了我们对Muc2功能特性的了解。人类黏液Muc2异常表达是多种疾病的标志，常被作为疾病免疫治疗和免疫诊断的靶标。近年来，鱼类黏蛋白研究也成为探究鱼类黏液细胞和黏膜免疫系统功能与机制的突破点，但是，由于示踪黏蛋白Muc2的关键免疫学试剂的缺乏，相关研究止步于黏液Muc2高分子糖链层面，在蛋白层面的研究工作仍属空白，阻碍了对鱼类Muc2特性及其黏膜防御功能以及黏液细胞免疫学功能研究的进展。因此，解析鱼类Muc2基因结构与特性，筛选抗原性高的氨基酸序列用于合成多肽，进而研制高效的Muc2特异性抗体制剂，对深入理解Muc2作为屏障和生化活性蛋白的分子功能，探究其与鱼类疾病发生的关系，推动鱼类黏膜免疫防御机制的研究至关重要。
[0004]牙鲆(Paralichthys olivaceus)是中国名优经济鱼类，但病害问题给牙鲆养殖业造成重大经济损失。本专利技术通过克隆牙鲆Muc2基因并制备特异性抗体，将其作为识别牙鲆黏液细胞以及黏蛋白的探针，应用于检测鱼类疾病或疫苗接种诱发的黏蛋白数量变化、评估黏液细胞状态及免疫应答水平等，为深入研究鱼类黏膜免疫防御机制及疾病免疫诊断提供有力工具，为新型鱼用黏膜疫苗研制提供重要支撑。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种牙鲆黏蛋白Muc2的特异性抗体及其制备方法和应用，所提供的牙鲆Muc2特异性抗体可用于检测牙鲆黏膜组织中的黏蛋白Muc2及Muc2阳性黏液细胞，为研究牙鲆黏液细胞及黏蛋白的应答变化，深入了解黏液细胞和黏液在固有黏膜免疫中的作用及其与疾病发生的关系提供重要工具。
[0006]本专利技术提供一种用于制备牙鲆Muc2特异性抗体的B细胞抗原表位多肽，其具体的氨基酸序列为VYRQDRSECTCLE(SEQ ID NO:1)；
[0007]本专利技术还保护上述的氨基酸序列为SEQ ID NO:1的B细胞抗原表位多肽的衍生多肽，即通过取代、缺失、添加一个或几个氨基酸所获得的多肽；
[0008]本专利技术还保护一种偶联蛋白，是在氨基酸序列为SEQ ID NO:1的B细胞抗原表位多肽的5
′
端或3
′
端偶联有用于增强免疫效果的分子；
[0009]本专利技术还提供一种特异性抗体，所述的特异性抗体是使用上述的抗原多肽免疫动物制备的；
[0010]所述的动物，作为实施例的具体记载，为Balb/c小鼠；
[0011]本专利技术中特异性抗体的制备方法，是将牙鲆Muc2的B细胞抗原表位与载体偶联后，免疫Balb/c小鼠，取血清后处理得到抗牙鲆Muc2特异性抗体。
[0012]所述的载体，作为实施例的具体记载，为KLH(血蓝蛋白)载体；
[0013]本专利技术所提供的牙鲆Muc2分子的特异性抗体在制备牙鲆黏蛋白Muc2鉴定试剂中的应用。
[0014]本专利技术所提供的抗牙鲆Muc2分子的特异性抗体在制备Muc2阳性黏液细胞免疫应答研究试剂中的应用。
[0015]本专利技术还提供一种在石蜡或冰冻切片中检测或示踪牙鲆Muc2及Muc2阳性黏液细胞的试剂盒，所述试剂盒包括:
[0016]1)抗原修复液(0.01M柠檬酸钠缓冲液，pH6.0)，用于在高温条件下打开醛类固定剂与抗原决定簇之间形成的交联键，暴露抗原表位；
[0017]2)3％牛血清白蛋白(BSA)封闭液(0.01M PBS配制)，用于封闭玻片上的非特异性结合位点降低非特异性吸附；
[0018]3)抗牙鲆Muc2分子的特异性抗体(1:500，0.01M PBS稀释)，用于识别牙鲆黏膜组织中的黏蛋白Muc2及其阳性细胞；
[0019]4)Cy3标记的羊抗鼠IgG抗体(1:1000，0.01M PBS稀释)，用于特异性识别Muc2特异性抗体，显示Muc2阳性细胞；
[0020]5)DAPI(1:2000，0.01M PBS稀释)，用于衬染细胞核。
[0021]所述0.01M柠檬酸钠缓冲液(pH6.0)中所含成分：3.8mL 0.1M柠檬酸溶液与16.2mL 0.1M柠檬酸钠缓冲液混合后加入蒸馏水至200mL；
[0022]所述0.01M PBS(1L，pH7.4)中所含成分：8.0g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4、0.24g KH2PO4，用HCl调节pH至7.4。
[0023]本专利技术克隆了牙鲆黏蛋白Muc2基因，筛选获得了牙鲆黏蛋白Muc2基因的B细胞抗原表位，使用该抗原表位序列制备抗原,并免疫动物制备了牙鲆黏蛋白Muc2的特异性抗体，为在基因和蛋白水平上检测疾病发生或疫苗接种诱发的牙鲆黏蛋白Muc2的表达变化提供了可能，为检测牙鲆Muc2蛋白及其阳性黏液细胞及靶标Muc2的疾病免疫诊断提供了重要工具。本专利技术实现对Muc2阳性黏液细胞的鉴定表征，并开展了后续验证。
附图说明
[0024]图1：以邻接法对Muc2分子构建的系统进化树图；
[0025]图2：牙鲆Muc2的跨膜序列及信号肽序列分析图；
[0026]图3：牙鲆Muc2蛋白结构域分析图；
[0027]图4：牙鲆Muc2分子的PTS域序列图。
[0028]图5：IEDB软件分析的Muc2的B细胞线性抗原表位预测图；
[0029]图6：牙鲆Muc2二级结构域图；
[0030]图7：DNAStar软件预测的Muc2分子的抗原表位参数分析图；
[0031]图8：Muc2蛋白分子三级结构模型及最终选择的抗原肽段。
[0032]图9：Western blot分析Muc2特异性抗体与牙鲆肠的天然黏液蛋白结合图，其中M表示marker，NC表示阴性对照。
[0033]图10：间接免疫荧光法分析Muc2特异性抗体与牙鲆前肠、中肠和后肠黏蛋白Muc2的特异性结合反应图(物镜倍数40
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗原多肽，其特征在于，所述的抗原多肽包含有：1)氨基酸序列为SEQ ID NO:1的多肽。2)在1)的多肽上通过取代、缺失、添加一个或几个氨基酸所获得的多肽。2.一种偶联蛋白，其特征在于，所述的偶联蛋白是权利要求1所述的抗原多肽的5
′
端或3
′
端偶联有用于增强免疫效果的分子。3.如权利要求2所述的偶联蛋白，其特征在于，所述的分子为KLH载体蛋白。4.一种特异性抗体，其特征在于，所述的特异性抗体是使用权利要求1所述的抗原多肽或权利要求2所述的偶联蛋白免疫动物制备的。5.如权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：绳秀珍，王锦诚，高建亮，战文斌，唐小千，邢婧，迟恒，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：