本发明专利技术公开了一种月季细胞的快速悬浮培养方法和高效遗传转化方法，月季细胞的快速悬浮培养方法包括(1)愈伤组织的诱导；(2)悬浮细胞的制备；(3)悬浮细胞的继代培养与保存；一种月季细胞的高效遗传转化方法包括(1)使用月季细胞的快速悬浮培养方法获得的月季悬浮细胞；(2)载体转化农杆菌；(3)农杆菌侵染月季悬浮细胞；(4)对已转染的悬浮细胞进行共培养和筛选培养；(5)遗传转化结果检测。本发明专利技术解决了现有技术尚未建立月季悬浮细胞遗传转化体系的问题，能在短时间快速培养大量的月季悬浮细胞，高效遗传转化月季悬浮细胞，快速实现在月季本体进行基因功能验证、亚细胞定位、蛋白表达、合成生物学研究等。成生物学研究等。成生物学研究等。
【技术实现步骤摘要】
月季细胞的快速悬浮培养方法和高效遗传转化方法
[0001]本专利技术属于生物
，涉及一种月季细胞的快速悬浮培养和高效遗传转化方法。
技术介绍
[0002]月季是蔷薇科蔷薇属植物，是世界范围内最重要的观赏作物之一，广泛应用于切花、盆花、庭院绿化以及道路美化等方面，应用历史超过5000年。我国作为世界蔷薇属植物的分布中心，产自我国的
‘
月月粉
’
和
‘
香水月季
’
等种质所携带的连续开花以及香味等重要性状在现代月季的育成中起到了至关重要的作用。
[0003]月季切花是世界切花之首，我国是世界月季生产面积最大的国家，2020年，月季产值达200亿元。月季基因组较小，2倍体古老品种
‘
月月粉
’
DNA含量约为1.2pg/2C，约为模式植物拟南芥(0.3pg/2C)的4倍。现代月季童期短，基因型世代仅约一年；月季植株可以反复开花，并且修剪后新萌发的枝条约40天就可开花，与模式植物拟南芥的生长周期相近。月季具有极为丰富的花型、花色和花香等在其他模式植物中无法研究的独特性状，而这些丰富的表型变异，结合现代组学工具，可较为方便地建立起基因位点和表型的关联。月季花朵尺寸较大，便于观察；大多数基因型容易进行无性繁殖，扦插后约40
‑
50d即可开花，便于在短期内获得大量的一致性材料。特别是现代月季多为重瓣花型，花瓣结构相对均一，生命周期短，且可在不造成实质性损伤的情况下进行多种处理。因此，月季可被作为观赏植物研究的模式植物。
[0004]基因修饰广泛用于分子研究和作物育种。然而，月季作为木本植物，不仅遗传转化周期较长，约8
‑
10个月，而且遗传转化效率低。遗传转化周期长和遗传转化效率低严重影响了月季基因功能研究和分子育种工作，因此，亟需开发一个快速高效的遗传转化和验证系统来提高月季遗传转化的效率，降低稳定转化失败的风险。
[0005]目前，月季的遗传转化主要是采用农杆菌介导的愈伤组织转化法。然而，愈伤组织作为遗传转化材料，存在着转化效率低的问题。植物的悬浮细胞由于具有良好的分散性、均一性，而且细胞增殖快，是进行遗传转化的良好材料。甘薯、水稻、烟草和杨树等多个作物上都已报道建立了高效的悬浮细胞遗传转化体系，而月季悬浮细胞系的建立和遗传转化目前尚未见报道。
技术实现思路
[0006]本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种月季细胞的快速悬浮培养方法，以及一种月季悬浮细胞的高效遗传转化方法，以解决现有技术尚未建立月季悬浮细胞遗传转化体系，以月季愈伤组织作为遗传转化材料存在的转化效率低的问题，为通过月季细胞培养快速进行基因功能验证、亚细胞定位和验证蛋白互作等提供有效途径，同时为基因工程改造月季奠定基础。
[0007]为实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案如下：
salt、0.8mg
·
L
‑1‑
1.2mg
·
L
‑
1 2,4
‑
D、0.8mg
·
L
‑1‑
1.2mg
·
L
‑
1 6
‑
BA、4.5％Glucose、0.3％Gel、280mg
·
L
‑1‑
300mg
·
L
‑1Cef、8mg
·
L
‑1‑
12mg
·
L
‑1Hygromyci。
[0028]进一步地，步骤4)所述质粒为pCAMBIA1300；所述农杆菌为EHA105。
[0029]有益效果：
[0030]1、本专利技术建立了月季细胞的快速悬浮培养方法，通过该方法的愈伤组织诱导条件能高效诱导出月季愈伤组织，得到的月季愈伤组织具有生长旺盛、不褐化等特点，可长期继代保存，对所得月季愈伤组织进行悬浮培养，能在14d快速获得大量的月季悬浮细胞。
[0031]2、以本专利技术建立的月季细胞的快速悬浮培养方法为基础，本专利技术还提供了月季悬浮细胞的高效遗传转化方法，该方法能高效转化月季细胞，可用于研究月季生长发育及分化的机制和遗传变异规律。
[0032]3、本专利技术建立了月季细胞的快速悬浮培养方法和高效的遗传转化方法，不仅周期短，而且遗传转化效率高，解决了月季本体无法实现过表达蛋白的问题，筛选14d可获得稳定转化的悬浮细胞系；还可快速实现在月季本体进行基因功能验证、亚细胞定位、蛋白表达、合成生物学研究等，从而可加快加深对月季花色、花香、衰老、胁迫等方面的研究。
附图说明
[0033]图1显示悬浮培养细胞制备与保存的结果图，A是诱导的愈伤组织图；B是制备的悬浮细胞系图；C是保存的悬浮细胞系图；
[0034]图2显示继代培养14d的悬浮细胞系活力与状态观测结果图；
[0035]图3显示阳性菌落GFP基因PCR电泳结果图；
[0036]图4显示悬浮细胞遗传转化结果荧光检测图；
[0037]图5显示遗传转化效率DNA水平GFP基因PCR电泳结果图；
[0038]图6显示遗传转化效率RNA水平GFP基因PCR电泳结果图；
[0039]图7显示Western Blot检测GFP蛋白表达结果图。
具体实施方式
[0040]下面通过实施例对本专利技术提供的月季细胞的快速悬浮培养和高效遗传转化方法作进一步说明。有必要指出，以下实施例只用于对本专利技术作进一步说明，不能理解为对本专利技术保护范围的限制，所属领域技术人员根据上述
技术实现思路
，对本专利技术做出一些非本质的改进和调整进行具体实施，仍属于专利技术保护的范围。
[0041]下述实施例中，所述诱导培养基的配方如下：
[0042][0043]下述实施例中，所述增殖培养基的配方如下：
[0044][0045]下述实施例中，所述无凝胶增殖培养基的配方如下：
[0046][0047][0048]下述实施例中，所述LB液体培养基的配方如下：
[0049][0050]下述实施例中，所述LB固体培养基的配方如下：
[0051][0052]下述实施例中，所述MS重悬溶液的配方如下：
[0053][0054]下述实施例中，所述共培养培养基的配方如下：
[0055][0056][0057]下述实施例中，所述选择增殖培养基的配方如下：
[0058][0059]下述实施例中，所述MS salt购自Caisson labs，货号MSP09；2，4
‑
D(2，4
‑
二氯苯氧乙酸)购自Coolaber，货号CC3511；KT(激动素，细胞分裂素类)购自Coolaber，货号CK6721；Glucose购自沪试，货号10010518；Gel购自SIGMA，货号P8169；6
‑
BA购自Coolaber，货号CB2611本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种月季细胞的快速悬浮培养方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)愈伤组织的诱导：选取月季幼嫩叶片，将选取的月季幼嫩叶片接种到诱导培养基中，进行愈伤组织诱导培养；将诱导的愈伤组织转移至增殖培养基中，进行增殖培养；(2)悬浮细胞的制备：选取步骤1)增殖培养1个月的愈伤组织；将选取的愈伤组织接种到无凝胶的增殖培养基中；将该培养基置于恒温震荡培养箱中进行培养，获得稳定的初代悬浮细胞；(3)悬浮细胞的继代培养：选取步骤2)获得的初代悬浮细胞再接种于无凝胶的增殖培养基上；将该无凝胶增殖培养基置于恒温震荡培养箱中培养，进而获得继代培养的月季悬浮细胞；(4)继代培养悬浮细胞的保存：对步骤3)获得的含有继代培养的月季悬浮细胞的无凝胶增殖培养基进行过滤，获得继代培养的月季悬浮细胞，取该细胞置于含凝胶的增殖培养基上进行继代保存。2.根据权利要求1所述的快速悬浮培养方法，其特征在于，步骤1)所述诱导培养基成分包括4.40g
·
L
‑1‑
4.45g
·
L
‑1MS salt、2.5mg
·
L
‑1‑
3.5mg
·
L
‑12,4
‑
D、0.05mg
·
L
‑1KT、30g
·
L
‑1Glucose、0.3％Gel。3.根据权利要求1所述的快速悬浮培养方法，其特征在于，步骤1)所述增殖培养基包括4.40g
·
L
‑1‑
4.45g
·
L
‑1MS salt、0.8mg
·
L
‑1‑
1.2mg
·
L
‑12,4
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D、0.8mg
·
L
‑1‑
1.2mg
·
L
‑16
‑
BA、6％Glucose、0.3％Gel。4.根据权利要求1所述的快速悬浮培养方法，其特征在于，步骤1)中所述愈伤组织诱导培养的条件是25℃，黑暗条件下，时间是2周；所述增殖培养的条件是25℃，黑暗条件下。5.根据权利要求1或2所述的快速悬浮培养方法，其特征在于，步骤2)所述培养的条件是25℃，黑暗条件下，130rpm/min震荡培养，每周更换一次培养基，持续4至8周，每周清除大块愈伤。6.一种使用权利要求1所述的月季悬浮细胞的高效遗传转化方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)载体转化农杆菌：将质粒转化到农杆菌菌株中，挑选转化成功的单菌落，接种于LB液体培养基中培养，离心去除上清液，收集阳性农杆菌；(2)用MS重...
【专利技术属性】
技术研发人员：马男，王成鹏，周晓锋，高俊平，程晨霞，李扬，王娜，俞芹，
申请(专利权)人：山东省农业科学院，
类型：发明
国别省市：
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