一种生姜外泌体的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种生姜外泌体的制备方法及应用，属于生物技术领域。制备操作如下：（1）将生姜去皮洗净，切成小块状，榨汁并将汁液分离；（2）采用差速高速离心法，将收集的汁液在4℃下差速高速离心分离，去除沉淀；结合聚乙二醇沉淀法，将上清液加入相应量的聚乙二醇溶液，旋涡混匀，在4℃下孵育、离心、沉淀纳米颗粒；（3）将纳米颗粒悬浮，过滤，纯化柱纯化，收集纯化液，即得到生姜外泌体。生姜外泌体的粒径为120～192 nm，生姜外泌体的表面负电荷为

【技术实现步骤摘要】
一种生姜外泌体的制备方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种生姜外泌体的制备方法。

技术介绍

[0002]植物源外泌体纳米颗粒是一种由细胞分泌的微小膜泡，约30
‑
300nm，类似于哺乳动物的外泌体，具有脂质双层膜结构，封装了蛋白质、脂质、DNA和各种RNA等。近年来，外泌体凭借其个体微小且性状稳定等优势在参与细胞间通讯、疾病诊断、疾病治疗等方面发挥重要作用。几乎所有的细胞都可以产生外泌体，不同细胞来源的外泌体中既包含与细胞形成、结构和物质转运相关的共有成分，也包含与来源细胞的生物功能相关的特异分子。在世界范围内，生姜是一种多年生植物，在食品和饮料中被广泛用作饮食调味品。研究表明，生姜的有益作用包括降低血小板聚集的风险，降低内皮功能障碍的风险，以及改善消化道疾病。生姜不仅富含膳食纤维、挥发性化合物和非挥发性生物活性物质，而且还含有与外泌体相似的纳米囊泡。在过去的几年里，植物外泌体已经被广泛发现，并有望作为一种新的天然生物活性成分来改善人类健康。
[0003]当我们进食时，食物中所含的外泌体可被人体内特殊的宿主细胞自然吸收，并进行信息的传递。人的胃肠道不可避免地会与植物外泌体发生接触，因而植物外泌体与肠道细胞的相互作用引起了广泛的关注。目前，植物外泌体介导的肠道疾病治疗进展缓慢，这主要是由于对植物外泌体与肠细胞的相互作用理解有限。植物外泌体的跨界调控功能可能是通过其所包含的货物，特别microRNAs (miRNAs)，从供体细胞到受体细胞，以及外泌体与细胞表面受体的结合来实现的。miRNAs是一类大小约22个核苷酸的非编码RNA，通过识别和切割靶mRNA或抑制翻译过程来影响靶基因的表达，从而参与调节多种生物途径。因此，人们对miRNAs在人类健康和疾病中的作用产生了浓厚的兴趣。然而，由于人工合成的miRNAs存在严重的靶内或脱靶等副作用，其使用一直存在争议。值得注意的是，植物外泌体中的miRNAs是稳定的、无毒的、且具有生物可利用性的。它们可以通过外泌体的运输到达目标组织，并在靶点处表现出极强的生物活性。因此，专利技术一种提取生姜外泌体（GELNs）的方法，并将所提取的GELNs应用于脂多糖（LPS）诱导的肠道炎症治疗即为本专利技术的研究重点。

技术实现思路

[0004]为了实现高效提取大量高纯度的生姜外泌体（GELNs），并有效抑制肠道炎症，本专利技术提供一种生姜外泌体（GELNs）的制备方法。
[0005]一种生姜外泌体（GELNs）的制备操作步骤如下：（1）将生姜去皮洗净，切成小块状，榨汁，并将汁液分离；（2）采用差速高速离心法，将收集的汁液在4000 g（离心力）、8000 g、12000 g、18000 g，4℃离心条件下分别各离心60min，去除细胞和细胞碎屑；采用聚乙二醇沉淀法，在20 mL上清液中加入5 mL聚乙二醇（PEG）溶液，旋涡混匀；在4℃下孵育2小时；然后在18000 g，4℃离心条件下，离心60 min，得到沉淀的纳米颗粒；
（3）将纳米颗粒用1
×
PBS悬浮，通过450 nm滤头过滤；在16000g，4℃离心条件下，用纯化柱纯化10 min；收集纯化液，即得到生姜外泌体；所述生姜外泌体的粒径为120～192 nm，生姜外泌体的表面负电荷为
‑
31.6～
‑
21.6 mV，生姜外泌体的蛋白浓度为2391.43
±
750 ng/μL。
[0006]本专利技术的有益技术效果体现在以下方面：1. 目前，差速超高速离心是生姜外泌体提取最主要的分离纯化方式，但这种提取方式需用冷冻超高速离心机这种大型设备，成本较高，难以广泛应用。本专利技术采取了差速高速离心法与聚乙二醇沉淀法相结合的方法，本专利技术方法操作简单、绿色、无毒，可提取大量的GELNs，通过鉴定表征，证实了制备所得的GELNs具有经典的茶托状结构以及理想的粒径（120～192 nm）和表面负电荷（
‑
31.6～
‑
21.6 mV），且其纯度极高（蛋白浓度为2391.43
±
750 ng/μL）。
[0007]2.本专利技术制备的GELNs在经荧光染料标记后，可在激光共聚焦显微镜下观察到在肠细胞中逐渐吸收的过程，且进一步分析表明GELNs在肠细胞中的有效内化作用主要与巨胞饮和小窝蛋白介导的内吞作用相关。
[0008]3.本专利技术制备的GELNs可有效抑制LPS诱导的肠细胞中NF
‑
κB和炎症细胞因子（TNF
‑
α，IL
‑
8和IL
‑
1β）的过度表达，并且GELNs的抗炎功能与其所含的miRNA有关，有望抑制或缓解肠道炎症。
附图说明
[0009]图1为本专利技术实施例1中生姜外泌体（GELNs）的提取示意图及表征分析图。
[0010]图2为本专利技术实施例2中肠细胞（Caco
‑
2）有效吸收GELNs的共聚焦显微镜图。
[0011]图3为本专利技术实施例2中不同内吞抑制剂对GELNs内化作用的影响图。
[0012]图4为本专利技术实施例3中GELNs对LPS诱导的Caco
‑
2细胞炎症的影响图。
具体实施方式
[0013]下面结合实施例，对本专利技术作进一步地描述。
[0014]实施例1一种生姜外泌体（GELNs）的制备操作步骤如下：（1）将生姜去皮洗净，切成小块状，放入榨汁机中。榨取的新鲜姜汁利用纱布过滤去除残渣，重复两次后分装于50 mL离心管中，得到汁液。
[0015]（2）采用差速高速离心法，将收集的汁液在4℃下进行梯度离心，4000 g（离心力）6000 g 、8000 g 、12000g、18000 g分别各离心1 h。采用聚乙二醇沉淀法，在20mL上清液中加入5mL 聚乙二醇沉淀，振荡混匀，4℃孵育2h。孵育完毕的混合液，在18000 g，4℃离心条件下，离心1 h，得到沉淀的纳米颗粒。
[0016]（3）将纳米颗粒用1
×
PBS悬浮沉淀，通过450 nm滤头过滤，并进一步将滤液置于纯化柱中，在16000g，4℃离心条件下，离心 10 min；收集纯化液，即得到生姜外泌体。将收集管中的纯化液分装至新的EP管中，并置于
‑
80℃保存。
[0017]参见图1中的A，本实施例1 GELNs的提取示意图，GELNs的形貌，生姜外泌体的粒径及zeta电位结果如图1所示。如图1中的B所示，在透射电镜下，GELNs呈茶托状、空杯状 。如
图1中的C所示，制备所得的生姜外泌体的粒径范围为120～192 nm ，如图1中的D所示，表面负电荷为
ꢀ‑
31.6～
‑
21.6 mV。此外，以牛血清血蛋白为标品，利用BCA蛋白定量测得GELNs的蛋白浓度为2391.43
±
750 ng/μL。
[0018]实施例2GE本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生姜外泌体的制备方法，其特征在于操作步骤如下：（1）采用差速高速离心法，将收集的生姜汁液在4000 g（离心力）、8000g、12000g、18000g，4℃离心条件下分别各离心60 min，去除细胞和细胞碎屑；采用聚乙二醇沉淀法，在20 mL上清液中加入5 mL聚乙二醇（PEG）溶液，旋涡混匀；在4℃下孵育2小时；然后在18000g，4℃离心条件下，离心60 min，得到沉淀的纳米颗粒；（2）将纳米颗粒...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑磊，操雅棋，颜玲，殷李芬，刘长虹，
申请(专利权)人：合肥工业大学，
类型：发明
国别省市：