一种利用石斛悬浮原球茎生产石斛酚的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用石斛悬浮原球茎生产石斛酚的方法，其是通过筛选获得高石斛酚含量的石斛悬浮原球茎，然后将其经诱导、继代与增殖、生物反应器连续培养后，收集培养产物并进行石斛酚的提取。本发明专利技术可以实现石斛酚的工厂化生产，其具有生物产量大、石斛酚含量稳定可控、节省人工、不受时空季节影响的特点，同时，通过优化的培养基，可有效提高石斛鲜品中石斛酚的含量。石斛酚的含量。

【技术实现步骤摘要】
一种利用石斛悬浮原球茎生产石斛酚的方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种利用石斛悬浮原球茎生产石斛酚的方法。

技术介绍

[0002]石斛酚（gigantol）为联苄类芳香化合物，是石斛属（Dendrodium sw）植物中相对特异的活性物质，具有较强抗炎、抗衰老、抗肿瘤等功效，是近年石斛的研究热点之一。石斛中石斛酚含量除了具有组织特异性与采收季节特异性外，在不同种的石斛间含量差异较大，如霍山石斛石斛酚含量在石斛属中处较高水平，为0.1
‑
0.2 mg/g，而铁皮石斛多低于0.02 mg/g至未检出，与金钗石斛（D.nobile）、鼓槌石斛（D.chrysotoxum）等收录药典石斛一样，属于石斛酚含量低的石斛种类。
[0003]石斛为我国传统名贵中药，为C3与景天酸混合代谢植物，其植株生长缓慢，栽培难度大，价格常年高居不下，而石斛酚在石斛中含量均在mg级，利用石斛作为原料进行石斛酚的提取具有价格昂贵，且易受到环境与气候影响的缺点，因此，石斛酚虽具有良好的药用价值，相关产业推进仍较慢。本专利技术可实现石斛原球茎工厂化生产，具有生物产量大、石斛酚含量稳定可控、节省人工、不受时空季节影响的优点。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，提供一种利用石斛悬浮原球茎生产石斛酚的方法，其利用高石斛酚含量的石斛原球茎通过生物反应器进行自动连续培养以实现石斛酚的工厂化生产，具有生物产量大、石斛酚含量稳定可控、节省人工、不受时空季节影响的特点；且通过在培养基中添加灭活的印度梨形孢培养物，可有效激活石斛酚合成相关基因的转录水平，提高石斛酚产量。
[0005]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种利用石斛悬浮原球茎生产石斛酚的方法，其包括以下步骤：（1）高石斛酚原球茎的诱导：于6
‑
7月，筛选当年生茎叶鲜品中石斛酚含量>0.1 mg/g的石斛茎段或叶作为外植体，经消毒灭菌后接种于诱导培养基进行诱导培养，连续诱导40
‑
60 d后，将获得的石斛悬浮原球茎进行石斛酚含量检测，保留石斛酚含量>0.2 mg/g的原球茎作为高石斛酚含量的石斛悬浮原球茎；（2）高石斛酚石斛原球茎的继代与增殖：将步骤（1）所获得的高石斛酚含量的石斛悬浮原球茎接种于继代增殖培养基中进行持续继代培养，继代培养周期为30
‑
45 d；（3）生物反应器连续培养：将步骤（2）所获得的石斛悬浮原球茎接种于液体培养基，接种量为10
‑
20 g鲜重/L，于生物反应器中进行培养；（4）原球茎收集与石斛酚提取：步骤（3）连续培养20
‑
30 d后，石斛悬浮原球茎生长达对数期， 每1
‑
2 d收集20
‑
30%培养产物，同时补足培养液并调整pH值为5.8；然后利用收集到的培养产物提取石斛酚。
[0006]进一步地，步骤（1）所述诱导培养基为1/2MS+BA 2.0
‑
4.0 mg/L+2,4
‑
D 1.0
‑
2.0 mg/L+蔗糖20 g/L+琼脂5.5 g/L，pH 5.8。
[0007]进一步地，步骤（1）的培养条件为25 ℃、16 h/d光照、光照强度2000 lx。
[0008]进一步地，步骤（2）所述继代增殖培养基为1/2MS+BA 0.5
‑
1.0 mg/L+蔗糖20 g/L+琼脂5.5 g/L，pH 5.8。
[0009]进一步地，步骤（2）继代培养的条件为25 ℃，16 h/d光照。
[0010]进一步地，步骤（3）所述液体培养基为1/2MS+BA 0.5
‑
1.0 mg/L+蔗糖30
‑
40 g/L+印度梨形孢灭活培养物5
‑
10 g/L，pH 5.8。
[0011]进一步地，步骤（3）所述生物反应器的设定条件为温度25 ℃、16 h/d光照、光照强度2000 lx、通气量为每L培养基按0.1 L/min的速率进行通气、搅拌速度为120转/min。
[0012]本专利技术的优点在于：1、石斛酚在不同种的石斛间含量差异较大，本专利技术选用具有高石斛酚种质作为外植体材料，可有效保证高石斛酚含量的石斛悬浮原球茎的建立。
[0013]2、本专利技术利用生物反应器连续培养石斛悬浮原球茎，通过连续收集，可保持石斛悬浮原球茎对数期增殖，从而可以在减少人工投入的情况下，提高石斛悬浮原球茎产量，降低石斛酚生产成本。
[0014]3、印度梨形孢为共生型有益真菌，其培养产物具有促进植物生长与次生代谢物累积的作用，本专利技术通过在培养基中添加生长调节剂及灭活印度梨形孢培养物等有机添加物共同作用，可有效激活石斛酚合成相关基因的转录水平，提高石斛酚产量。
附图说明
[0015]图1为不同品种石斛茎、叶中石斛酚含量的对比图；图2为添加不同含量印度梨形孢灭活培养物连续培养不同天数悬浮原球茎中石斛酚含量的对比图；图3为
‘
明斛3号
’
高石斛酚含量原球茎进行继代培养的效果图；图4为
‘
明斛3号
’
高石斛酚含量原球茎进行连续培养过程中石斛酚含量的变化曲线。
具体实施方式
[0016]为了使本专利技术所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本专利技术所述的技术方案做进一步的说明，但是本专利技术不仅限于此。
[0017]所用印度梨形孢灭活培养物是将印度梨形孢于100℃水浴灭活5min制得。
[0018]实施例1（1）高石斛酚石斛原球茎的诱导：于6月20日，筛选当年生茎叶鲜品中石斛酚含量>0.1 mg/g的石斛种质“14L
‑
3”的叶作为外植体，75%酒精消毒30 s，0.1%升汞灭菌10 min后接种于1/2MS+BA 3.5 mg/L+2,4
‑
D 1.5 mg/L+蔗糖20 g/L+琼脂5.5 g/L、pH 5.8的诱导培养基中，接种量为100 mg鲜重/L，于25 ℃、16 h/d光照、光照强度2000 lx的条件下连续诱导45 d后获得石斛悬浮原球茎，对其进行石斛酚含量检测，保留石斛酚含量>0.2 mg/g的原球茎作为高石斛酚含量的石斛悬浮原球茎；
（2）高石斛酚石斛原球茎的继代与增殖：将步骤（1）所获得的石斛悬浮原球茎接种于1/2MS+BA 0.8mg/L+蔗糖20 g/L+琼脂5.5 g/L、pH 5.8的继代增殖培养基中，接种量为100 mg鲜重/L，于25 ℃，16 h/d光照条件下持续继代培养，继代周期为35 d；（3）生物反应器连续培养：将步骤（2）所获得的石斛悬浮原球茎于接种于1/2MS+BA 0.8 mg/L+蔗糖40 g/L+印度梨形孢灭活培养物5 g/L、pH 5.8的液体培养基中，接种量为20g鲜重/L，设生物反应本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用石斛悬浮原球茎生产石斛酚的方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）高石斛酚原球茎的诱导：于6
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7月，筛选当年生茎叶鲜品中石斛酚含量>0.1 mg/g的石斛茎段或叶作为外植体，经消毒灭菌后接种于诱导培养基进行诱导培养，连续诱导40
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60 d后，将获得的石斛悬浮原球茎进行石斛酚含量检测，保留石斛酚含量>0.2 mg/g的原球茎作为高石斛酚含量的石斛悬浮原球茎；（2）高石斛酚石斛原球茎的继代与增殖：将步骤（1）所获得的高石斛酚的石斛悬浮原球茎接种于继代增殖培养基中进行持续继代培养，继代培养周期为30
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45 d；（3）生物反应器连续培养：将步骤（2）所获得的石斛悬浮原球茎接种于液体培养基，接种量为10
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20 g鲜重/L，于生物反应器中进行培养；（4）原球茎收集与石斛酚提取：步骤（3）连续培养20
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30 d后，石斛悬浮原球茎生长达对数期， 每1
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2 d收集20
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30%培养产物，同时补足培养液并调整pH值为5.8；然后利用收集到的培养产物提取石斛酚。2. 根据权利要求1所述的一种利用石斛悬浮原球茎生产石斛酚的方法，其特征在于：步骤（1）所述诱导培养基为1/2MS+BA 2.0
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【专利技术属性】
技术研发人员：颜沛沛，叶炜，江金兰，王培育，
申请(专利权)人：三明市农业科学研究院，
类型：发明
国别省市：