藜麦原生质体、制备方法以及梭梭耐逆基因瞬时表达体系技术

本发明专利技术公开了一种藜麦原生质体、制备方法以及梭梭耐逆基因瞬时表达体系。本发明专利技术通过将预处理的藜麦幼嫩子叶切取成0.5～1mm宽的细长条后置于酶解液中，25℃恒温条件下避光酶解10.5h，50rpm

【技术实现步骤摘要】
藜麦原生质体、制备方法以及梭梭耐逆基因瞬时表达体系


[0001]本专利技术属于生物
，尤其涉及一种藜麦原生质体及其制备方法，以及基于该藜麦原生质体的梭梭耐逆基因瞬时表达体系。

技术介绍

[0002]植物原生质体是指完全消除细胞壁的植株活细胞，其继续保持活体细胞一般的生长、分裂等生物活力，在特定的生长环境下，依然能够具有继续形成出新的植物能力的细胞。植物原生质体技术目前已被广泛应用于植物基因组定位、启动子活性、蛋白相互作用和植物育种技术等方面的研究，而基于植物原生质体的相关技术开发也已经成为了植物分子生物学科研的主要技术手段，原生质体瞬时分析系统已被广泛用于利用细胞和生化方法对基因进行快速功能分析。尽管对某些模式的植物原生质体的酶解分离技术已相当完善，但是几乎全部的研究资料都已经指出，对于不同的植物类型，或者同种植物不同的被试细胞材料，其对原生质体的分离能力也有着巨大差别。酶解液配合浓度、渗透剂浓度和酶解时间对酶解法制备原生质体有着及其重要的影响。
[0003]制备成熟的原生质体体系已在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中取得成功。目前，在制备原生质体的方面前人研究已对玉米(Zea mays)根尖组织、橡胶树(Hevea brasiliensis)、矮牵牛(Petunia hybrida)、水稻(Oryza sativa)、杉木(Cunninghamia lanceolata)、苹果(Malus pumila)、陆地棉(Gossypium hirsutum)、苦荞(Fagopyrum tataricum)、油菜(Brassica campestris)等叶片，荔枝(Litchi chinensis)、大豆(Glycine max)等愈伤组织，红豆草(Onobrychis viciifolia)下胚轴，以及梭梭(Haloxylon ammodendron)同化枝的原生质体分离条件进行了优化，获得较为成熟的原生质体瞬时表达体系。在制备原生质体时，不同部位对分离时的条件不同，分离成活效果也大相径庭，叶片往往能更容易分离出大量的原生质体。研究发现加入合适浓度的PVP能够防止原生质体褐化，提高原生质体的成活率。但是，通过愈伤组织获得原生质体相对直接采用现成的植物材料，操作难度较大，所需时间较长，不利于研究与叶片叶绿体相关的目标基因的表达定位分析。1992年有报道制备了藜麦(Chenopodium quinoa)原生质体，但其制备藜麦原生质体方法时间较长，且需要辅助病毒参与才能进行原生质体转化。因而优化其制备方法有助于对后续藜麦的研究。
[0004]藜麦是世界范围内广泛种植的一种异源四倍体盐生假谷物作物，源于南美洲安第斯高原提提喀喀湖地区，为一年生苋科(Amaranthaceae)藜属(Chenopodium)植物，也被称作印第安麦、南美藜、奎藜等。是唯一经过认定的能够提供人体基本营养且具有一定药用价值的单体食物。藜麦具有一定的抗寒性，能够在我国的高寒，高海拔地区种植，不仅可以丰富高海拔地区的特色农作物种类，还有助于缓解我国的粮食紧张问题。近年来，随着人们对健康的关注和高品质生活的追求，对藜麦的需要量正迅速上升，加之藜麦可有效减少全国粮食安全，目前对其的种植和养殖技术等基础研究都已形成体系热点。
[0005]黎科(Chenopodiaceae)植物梭梭(Haloxylon ammodendron)，呈较高灌木状，为超
旱生的小树木，又有“梭梭柴”、“盐木”、“琐琐树”等别名。梭梭广泛分布在中国西北沙漠地带的砾石戈壁风区、流动沙丘、盐渍土、半固定沙丘等，是中国西北荒漠地带最主要的防风固沙植物，可以适应风蚀、高热、瘠薄、干燥等严酷的自然环境，是优秀的防风固沙和生态防护植物，同时也是中国防风固沙和荒漠绿化的优选物种，然而目前尚无成熟的梭梭遗传转化体系影响了梭梭耐逆基因的研究。由于梭梭细胞特化难以获得原生质体用于遗传转化，而藜麦是梭梭的近缘物种且无细胞特化，所以可用藜麦的原生质体进行梭梭耐逆基因的瞬时表达，进行梭梭耐逆基因表达蛋白的亚细胞定位研究。

技术实现思路

[0006]为克服现有技术的缺点和不足，本专利技术的目的在于提供一种藜麦原生质体及其制备方法，以及基于该藜麦原生质体的梭梭耐逆基因瞬时表达体系。
[0007]本专利技术是这样实现的，一种采用藜麦幼嫩叶片制备藜麦原生质体的方法，该方法包括以下步骤：
[0008](1)藜麦幼嫩子为生长11天的藜麦幼嫩子，预处理为使用75％酒精进行消毒，并迅速晾干。将预处理的藜麦幼嫩子叶切取成0.5～1mm宽的细长条后置于酶解液中，25℃恒温条件下避光酶解10.5h，50rpm
·
min
‑1震荡1.5h，得到酶解液；其中，所述酶解液pH为5.7、酶解液组成为0.3％ MacerozymeR
‑
10+1.2％ Cellulase
‑
R10+0.6mol
·
L
‑1甘露醇+20mmol
·
L
‑1MES+20mmol
·
L
‑1KCl+10mmol
·
L
‑1CaCl2+0.5％PVP+1g
·
L
‑1BSA；
[0009](2)往所述酶解液中添加等体积的W5水溶液，经100目筛网过滤，在室温、100
×
g速率下离心4min，弃上清液体，得到藜麦原生质体。
[0010](3)往所得到的原生质体中添加W5水溶液重悬，在冰上放置30min，在室温、100
×
g速率下离心2min，弃上清液体，加入W5溶液重悬，得到提纯后的原生质体。
[0011]本专利技术进一步公开了上述方法制备得到的藜麦原生质体。
[0012]本专利技术进一步公开了一种藜麦原生质体的梭梭耐逆基因瞬时表达体系。
[0013]所述耐逆基因包括HaFT
‑
1基因，HaFT
‑
1基因的表达蛋白定位在藜麦原生质体的细胞质中。
[0014]本专利技术克服现有技术的不足，提供一种藜麦原生质体及其制备方法，以及基于该藜麦原生质体的梭梭耐逆基因瞬时表达体系。为了减少因转化细胞亲缘关系过远而导致的蛋白定位不准确或无法定位等问题，本专利技术以藜麦幼嫩的子叶叶肉细胞为材料，研究纤维素酶和离析酶的浓度配比、酶解时间、甘露醇浓度等因素对藜麦子叶叶肉细胞原生质体分离与纯化的重要影响。结果表明在溶液pH为5.7、酶解液组成为0.3％ MacerozymeR
‑
10+1.2％Cellulase
‑
R10+0.6mol
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L
‑1甘露醇+20mmol
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‑1MES+20mmol
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L
‑1KCl+10mmol
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‑1CaCl2+0.5％PVP+1g
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‑1BSA下，25本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种采用藜麦幼嫩叶片制备藜麦原生质体的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)将预处理的藜麦幼嫩子叶切取成0.5～1mm宽的细长条后置于酶解液中，25℃恒温条件下避光酶解10.5h，50rpm
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min
‑1震荡1.5h，得到酶解液；其中，所述酶解液pH为5.7、酶解液组成为0.3％MacerozymeR
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10+1.2％Cellulase
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R10+0.6mol
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‑1甘露醇+20mmol
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‑1MES+20mmol
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‑1KCl+10mmol
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‑1CaCl2+0.5％PVP+1g
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‑1BSA；(2)往所述酶解液中添加等体积的W...

【专利技术属性】
技术研发人员：王波，马洲洋，潘绒，任文静，
申请(专利权)人：新疆农业大学，
类型：发明
国别省市：