一种辣椒原生质体的分离及瞬时转化方法技术

本发明专利技术公开了一种辣椒原生质体的分离及瞬时转化方法，包括以下步骤：取辣椒植株第5~7片无菌真叶进行酶解，得到含辣椒叶肉细胞原生质体的酶解混合液，将所述酶解混合液过滤，滤液离心后得到原生质体沉淀，重悬后获得辣椒原生质体混悬液，利用PEG介导法进行外源基因的瞬时转化。通过实验证明：利用本发明专利技术的分离方法得到的辣椒原生质体的产量高达（11.09~11.79）

【技术实现步骤摘要】
KCl，10 mM CaCl2，5mM β
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巯基乙醇，0.1% BSA；S3：将含辣椒叶肉细胞原生质体的酶解混合液过滤离心，得到原生质体沉淀，重悬后获得辣椒原生质体混悬液；S4：利用PEG介导法进行外源基因的瞬时转化；其中，所述转化体系为：20μg质粒，100 μL辣椒原生质体混悬液，110 μL PEG溶液；所述转化条件为：将转化体系轻柔混匀后于室温孵育20 min；所述PEG溶液的制备方法为：称取3.5 g PEG4000，加入2.5 ml 0.8M甘露醇和1 mL 1M CaCl2，加超纯水定容至10 mL。
[0007]其中，所述GM培养基配方为：2.2 g/L MS粉末 + 15 g/L蔗糖 + 2.7 g/L植物凝胶，pH=5.72。
[0008]其中，所述辣椒原生质体混悬液获得方法为：将含辣椒叶肉细胞原生质体的酶解混合液用孔径75 mm的尼龙网过滤，滤液以100 g离心2 min，去除上清液，用W5溶液重悬原生质体沉淀，普通光学显微镜下用血球计数板观察计数，将原生质体密度调节至2
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106个/mL，后冰上放置30 min，以100 g离心2 min，去除上清液，用MMG溶液重悬、保持原生质体密度为2
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106个/mL，即获得辣椒原生质体混悬液；其中，所述尼龙网需提前用W5溶液润洗。
[0009]其中，所述利用PEG介导法进行外源基因的瞬时转化具体为：在离心管中加入20 μg质粒、100 μL辣椒原生质体混悬液和110 μL PEG溶液，将转化体系轻柔混匀后于室温孵育20 min，后加入440 μL W5溶液，轻柔颠倒混匀终止反应，然后以100 g离心2 min，去除上清液，加入1 mL WI溶液重悬沉淀，并于23℃暗培养16 h，完成转化。
[0010]其中，所述质粒为pBinGFP2植物表达质粒。
[0011]其中，所述W5溶液配方为：2 mM pH=5.7 MES缓冲液，154 mM NaCl，125 mM CaCl2，5 mM KCl，5 mM葡萄糖。
[0012]其中，所述MMG溶液配方为：4 mM pH=5.7 MES缓冲液，0.4 M甘露醇，15 mM MgCl2。
[0013]其中，所述WI溶液配方为：4 mM pH=5.7 MES缓冲液，0.5 M甘露醇，20 mM KCl。
[0014]上述一种辣椒原生质体的分离及瞬时转化方法在外源基因表达中的应用。
[0015]本专利技术的显著优点在于：1）本专利技术提供了一种高效的辣椒叶肉细胞原生质体分离方法，利用此方法，得到的辣椒原生质体产量约为11
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106个/g FW，活力在85%以上。
[0016]2）本专利技术提供了一种适合辣椒原生质体瞬时转化的方法，利用此方法，约64%的原生质体能被成功转化。
附图说明
[0017]图1：明场通道100 μm标尺下的辣椒原生质体分离效果图。
[0018]图2：PEG4000浓度和转化时间对辣椒原生质体的瞬时转化效率的影响。
[0019]图3：荧光通道10 μm标尺下GFP报告基因载体在辣椒原生质体中的瞬时表达示意图。
具体实施方式
[0020]为了使本专利技术所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本专利技术所述的技术方案做进一步的说明，但是本专利技术不仅限于此。
[0021]实施例1：辣椒原生质体的分离本专利技术提供了一种高效的辣椒原生质体的分离方法，其具体步骤为：1）供体材料的准备选取籽粒饱满的辣椒成熟种子，在超净工作台中先用适量的体积分数70%乙醇浸泡消毒30 sec，无菌水快速冲洗1次、每次2 min；再用质量分数0.1%升汞浸泡消毒6 min（期间需不断震荡，确保灭菌彻底），然后用无菌水冲洗3 ~ 4次、每次2 min。之后将灭菌后的种子倒入无菌的含有2层无菌滤纸的培养皿中，在超净工作台上吹干，大约需要5 min；挑取吹干后的种子接种于含有GM培养基（2.2 g/L MS + 15 g/L蔗糖 + 2.7 g/L植物凝胶；pH=5.72）的培养瓶中，于25℃、70%相对湿度、14 h光照（70 μM/m
2 /s）/10 h黑暗条件下培养，待辣椒植株第7片真叶刚完全展开时，剪取第5~7片无菌真叶作为供试材料。若仅用于瞬时表达研究，也可以将辣椒成熟的种子直接播于由泥炭土和蛭石按质量比2：1混合配置的土壤基质中，在25℃、70%相对湿度、14 h光照（70 μM/m
2 /s）/10 h黑暗条件下的温室中生长，待辣椒植株第7片真叶刚完全展开时，剪取第5~7片真叶作为供试材料。
[0022]2）辣椒原生质体的分离与纯化先提前配制好以下试剂：酶解液：酶解液A：1%(wt/vol)纤维素酶R
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10（Cellulose R10），0.5%(wt/vol) 离析酶R
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10（Macerozyme R10），20 mM MES缓冲液（pH=5.7），0.4 M甘露醇（mannitol），20 mM KCl，10 mM CaCl2，5mM β
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巯基乙醇，0.1% (wt/vol) BSA；酶解液B：1.25%(wt/vol)纤维素酶R
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10（Cellulose R10），0.3%(wt/vol)离析酶R
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10（Macerozyme R10），20 mM MES缓冲液（pH=5.7），0.4 M甘露醇（mannitol），20 mM KCl，10 mM CaCl2，5mM β
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巯基乙醇，0.1% (wt/vol) BSA；酶解液C：1.5%(wt/vol)纤维素酶R
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10（Cellulose R10），0.4%(wt/vol)离析酶R
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10（Macerozyme R10），20 mM MES缓冲液（pH=5.7），0.4 M甘露醇（mannitol），20 mM KCl，10 mM CaCl2，5mM β
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巯基乙醇，0.1% (wt/vol) BSA。
[0023]W5溶液：2 mM MES缓冲液（pH=5.7），154 mM NaCl，125 mM CaCl2，5 mM KCl，5 mM葡萄糖。
[0024]MMG溶液：4 mM MES缓冲液（pH=5.7），0.4 M甘露醇（mannitol），15 mM MgCl2。
[0025]以上试剂均需要经过0.22 μm微孔过滤膜过滤灭菌。
[0026]首先以辣椒品种CM334第5~7片无菌真叶为供体材料，用锋利刀片去除叶片的主叶脉，然后将叶片中间部位切成宽0.5 mm的细条，取1g叶片细条快速置于上述不同的10 mL酶解液中完全浸没，在23℃、黑暗条件下进行酶解3 h，得到含辣椒叶肉细胞原生质体的酶解混合液。之后将含辣椒叶肉细胞原生质体的酶解混合液用孔径为75 mm的尼龙网过滤（尼龙网需提前用W5溶液润洗），滤液转入5本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种辣椒原生质体的分离及瞬时转化方法，其特征在于：包括以下步骤：S1：选取籽粒饱满的辣椒成熟种子，在超净工作台中进行消毒，将消毒后的种子在超净工作台上吹干，接种于GM培养基上进行培养，待辣椒植株第7片真叶刚完全展开时，剪取第5~7片无菌真叶作为供试材料；S2：将剪取的无菌真叶去除主脉，切成宽0.5 mm的细条，浸没于酶解液中，在23℃、黑暗条件下酶解4h，得到含辣椒叶肉细胞原生质体的酶解混合液；其中，所述酶解液配方为：1.25%纤维素酶R
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10，0.3%离析酶R
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10，20 mM pH=5.7 MES缓冲液，0.4 M甘露醇，20 mM KCl，10 mM CaCl2，5mM β
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巯基乙醇，0.1% BSA；S3：将含辣椒叶肉细胞原生质体的酶解混合液过滤，滤液离心后得到原生质体沉淀，重悬后获得辣椒原生质体混悬液；S4：利用PEG介导法进行外源基因的瞬时转化；其中，所述转化体系为：20μg质粒，100 μL辣椒原生质体混悬液，110 μL PEG溶液；所述转化条件为：将转化体系轻柔混匀后于室温孵育20 min；所述PEG溶液的制备方法为：称取3.5 g PEG4000，加入2.5 ml 0.8M甘露醇和1 mL 1M CaCl2，加超纯水定容至10 mL。2.根据权利要求1所述的一种辣椒原生质体的分离及瞬时转化方法，其特征在于：所述GM培养基配方为：2.2 g/L MS粉末 + 15 g/L蔗糖 + 2.7 g/L植物凝胶，pH=5.72。3.根据权利要求1所述的一种辣椒原生质体的分离及瞬时转化方法，其特征在于：所述辣椒原生质体混悬液获得方法为：将含辣椒叶肉细胞原生质体的酶解混合液用孔...

【专利技术属性】
技术研发人员：程伟，朱莉云，储谟立，李园，王楠，
申请(专利权)人：安徽师范大学，
类型：发明
国别省市：