一种星油藤叶片细胞来源的原生质体的制备方法与质粒转化方法技术

本发明专利技术公开了一种星油藤叶片细胞来源的原生质体的制备方法与质粒转化方法。本发明专利技术通过优化星油藤叶片酶裂解时间，裂解温度和试剂使用浓度等条件，获得了高效的星油藤叶片原生质体分离方法。在此基础上，摸索了星油藤原生质体瞬时转化的方法，成功将带有GFP(绿色荧光蛋白)的外源质粒转化到星油藤叶片原生质体。该方法可以进一步用于基因功能分析。本发明专利技术为星油藤功能基因分析建立了一种快速有效的瞬时转化体系，为后期星油藤关键功能基因的深入研究奠定了工作基础。研究奠定了工作基础。研究奠定了工作基础。

【技术实现步骤摘要】
一种星油藤叶片细胞来源的原生质体的制备方法与质粒转化方法


[0001]本专利技术涉及植物
，具体涉及一种星油藤叶片细胞来源的原生质体的制备方法与质粒转化方法。

技术介绍

[0002]原生质体(protoplast)指采用机械或酶解法去掉了细胞壁的裸露细胞，植物原生质体在作物遗传改良和植物学研究中具有较大的应用潜力。原生质体可以用于种质资源保存(超低温保存)、原生质体融合创制优良新品种(细胞杂交)、筛选突变体(细胞无性系变异)、以及遗传转化。由于去掉了细胞壁，使原生质体容易摄入外源遗传物质，如果具有再生能力，容易获得转化植物。尤其是在新兴的植物基因编辑领域，由于瞬时基因转化和表达，再生植物不携带外源片段，在作物育种中具有很大的应用前景。此外，原生质体是基因瞬时表达的理想材料，已广泛用于蛋白质亚细胞定位、启动子活性和蛋白质相互作用等研究。
[0003]星油藤(PlukenetiavolubilisL.)又名印加果(SachaInchi)、印加花生(Inca Peanut)，是大戟科多年生木质藤本植物，其种子富含油脂(约占种子干重的45本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种星油藤叶片细胞来源的原生质体的制备方法，其特征在于包括如下步骤：（1）选取正常生长状况下幼嫩的星油藤真叶2片；黑暗条件下，用真空泵抽真空，用锡箔纸包好培养皿，室温放到摇床上以最小幅度，震荡过夜裂解；（2）在显微镜下检查原生质体释放情况，观察到较多单个细胞即可停止酶裂解反应，向原生质体酶解液中加入等体积4 ℃ 预冷的W5溶液，所述的原生质体酶解液与W5溶液的体积比为1：1；（3）用W5溶液润湿100目筛网，将原生质体酶解液过滤到50mL圆底离心管，离心机调到soft模式，22℃，100g离心5min，去除上清液，用10ml W5溶液轻柔地重悬原生质体，冰上静置待原生质体自然沉降。2.根据权利要求1所述的星油藤叶片细胞来源的原生质体的制备方法，其特征在于：在步骤（1）中，植株上最新展开且面积未超过子叶的幼嫩叶片，用刀片小心把叶片切成小于1mm细叶条，尽量去掉叶脉组织。3.根据权利要求1所述的星油藤叶片细胞来源的原生质体的制备方法，其特征在于：在步骤（1）中，切好的叶条完全浸入提前配置的30ml酶解液，所述的酶解液配置方法为：15g/L纤维素酶RS， 4g/L解离酶，0.4M甘露醇，20mM MES， 20mM KCl， 10mM CaCl2， 1g/L BSA，余量为去离子水，pH为5.7，所述室温为22 ℃；所述的抽真空时间为1小时，所述的最小幅度为50 rpm，震荡过夜时间为12
‑
16h。4.根据权利要求1所述的星油藤叶片细胞来源的原生质体的制备方法，其特征在于：在步骤（2）中，获得原生质体后，进行GFP绿色荧光蛋白载体的瞬时转化，步骤如下：将上述原生质体溶液分装至2ml EP管，每支200ul；加入GFP载体5ul
‑
10ul，浓度大于200 ...

【专利技术属性】
技术研发人员：阳天泉，代欢，李飞，徐伟，李红梅，马俊超，
申请(专利权)人：中国科学院昆明植物研究所，
类型：发明
国别省市：