马尾松胚性细胞培养基及细胞成熟培养方法技术

本发明专利技术涉及生物领域，马尾松胚性细胞培养基及细胞成熟培养方法，本申请根据继代次数和增殖系数的研究实验，精确选取适合进行组织培养的马尾松胚性细胞；将马尾松的组织培养分成预培养、成熟培养和后熟培养三个步骤，然后通过筛选和优化，获取能有效还原清除ROS的还原剂，通过组分优化获得适合马尾松胚性细胞生长的预培养培养基、成熟培养基和后熟培养基，使得马尾松胚性细胞成熟效果显著改善形成了一套高效的马尾松体胚育苗技术体系。套高效的马尾松体胚育苗技术体系。套高效的马尾松体胚育苗技术体系。

【技术实现步骤摘要】
马尾松胚性细胞培养基及细胞成熟培养方法


[0001]本专利技术涉及生物
，特别涉及马尾松胚性细胞培养基及细胞成熟培养方法。

技术介绍

[0002]马尾松(Pinus massoniana)是我国南方主要的造林用材和生态建设树种，其综合利用价值高、推广前景广阔，它不仅可用来生产三板、造纸及化纤工业制造，还可用来生产松香、松节油等工业原料。近年来，随着人们日益增长的生活需求与木材资源短缺、石油等不可再生资源逐渐枯竭、桉树纯林生态问题等矛盾的激化，生态、经济和社会的可持续发展越来越受到社会关注。基于我国生态安生、资源安全与社会安全等问题，马尾松作为我国主要的工业用材树种和生物质能源树种，大力发展马尾松人工林对调整林分结构，改善供需矛盾，实现林业生态、经济平衡发展很有必要。
[0003]自上世纪八十年代以来，在马尾松种质资源收集、保存及良种选育方面，我国取得了较大进步。但近年来，由于马尾松种子园母树老化，产量降低，良种匮乏，导致林分遗传分化差异大，人工林生产力低下。种苗良种化欠缺与育种周期长等问题，严重限制和阻碍了马尾松产业的发展。无性系的建立是加速树种品种改良和良种繁育的基础。
[0004]体胚发生(somatic embryogenesis,SE)又称体细胞胚胎发生，是已分化的体细胞去分化、再分化、发育成具有胚芽、胚轴、胚根，形成与合子胚相似的胚状体的一种组织培养方式。SE途径的植株再生，具有数量多、繁殖速度快、结构完整、植株再生率高、不受季节影响等特点，特别是与液氮冷冻保存技术结合后，对特定优良基因型拥有无限扩繁的潜力。另外，SE发育初期中获得的胚性愈伤组织是一种全能性干细胞，具有多向分化潜能，是基因工程遗传转化的良好受体细胞。尤其是SE技术与传统杂交育种程序相结合，在林木种质创新，培育速生、优质、抗逆林木新品种方面，能极大地缩短育种周期、提高育种效率，从而为发展多目标品种林业提供了强有力的生物技术工具。
[0005]在马尾松体胚育苗方面，目前虽有以马尾松成熟种子诱导体胚发生的报道，但技术成熟度低，难以在生产上应用。南京林业大学和中南林业科技大学曾先后报道了马尾松不同成熟度的幼胚离体培养，诱导愈伤组织和体胚发生，但尚未实现田间植株转化与应用。从马尾松体胚发生步骤来看，获得发育良好的成熟胚性细胞是构建高效马尾松体胚育苗技术的关键。胚性细胞成熟与继代培养材料的活力密切相关。研究证明，植物组织培养属于一种复合胁迫，在培养过程中受胁迫条件的影响会生产活性氧类物质，而植物会通过自我调控机制进行这类物质的还原与清除，因此不同培养阶段会呈现出不同的还原性或氧化性特征。
[0006]为此，有必要针对马尾松体胚发生过程中氧化还原特征，探讨氧化还原剂及相关信号物质对马尾松体胚成熟的影响，优化相关参数，改善马尾松胚性细胞成熟效果，构建马尾松高效体胚育苗技术体系，为马尾松育苗提供强有力的技术支撑。

技术实现思路

[0007]鉴于上述内容，有必要针对马尾松体胚发生过程中氧化还原特征，探讨氧化还原剂及相关信号物质对马尾松体胚成熟的影响，优化相关参数，改善马尾松胚性细胞成熟效果，构建马尾松高效体胚育苗技术体系，为马尾松育苗提供强有力的技术支撑。
[0008]为达到上述目的，本专利技术所采用的技术方案为：
[0009]马尾松胚性细胞培养基，所述培养基由预培养培养基、成熟培养基和后熟培养基组成；其中，预培养培养中包含50～100g/L的连二亚硫酸钠、1g/L的NiCl2·
6H2O和40～60mg/L的Nifedipine(硝苯地平)；成熟培养基和后熟培养基包含0.2～0.4g/L丁硫氨酸亚砜胺。
[0010]进一步的，所述预培养培养基还包括：DCR培养基、30g/L的蔗糖、3.5g/L的植物凝胶、2g/L的2,4
‑
D、0.5g/L的6
‑
BA、0.5g/L的酸水解酪蛋白和0.45g/L的谷胺酰胺；所述成熟培养基还包括：DCR培养基、60g/L蔗糖、4.5g/L植物凝胶、6g/LABA和0.5g/L谷胺酰胺；所述后熟培养基还包括：DCR培养基、15g/L的蔗糖、5.5g/L的植物凝胶、2.5g/L的活性碳、0.5g/L的GA和0.6g/L的NAA和0.5g/L的谷胺酰胺。
[0011]进一步的，所述方法为：选择常规增殖培养条件下继代次数5～10次、增殖系数>8，白色透明、颗粒状且成团性好的胚性细胞作为培养材料；将培养材料转至预培养基中预培养，预培养完成后，将细胞转接至成熟培养基中进行成熟培养；挑取成熟培养后分化成型的胚细胞转移至后熟培养基上进行后熟培养即完成。
[0012]进一步的，所述预培养的培养条件为：在弱光、20
±
0.5℃条件下培养，每14天周转1次，连续周转2次。
[0013]进一步的，所述成熟培养的培养条件为：在弱光、25
±
0.5℃条件下培养2个月，每个月周转1次。
[0014]进一步的，所述成熟培养的培养条件为：在弱光、4℃条件下培养7
‑
10天，然后转至弱光、28
±
0.5℃下培养14天。
[0015]进一步的，所述弱光条件为：800lx，光质为3:1:1的红光、蓝光和白光。
[0016]本专利技术具有如下有益效果：
[0017]植物组织培养属于一种复合胁迫，在培养过程中受胁迫条件的影响会生产活性氧类物质，而植物会通过自我调控机制进行这类物质的还原与清除，因此不同培养阶段会呈现出不同的还原性或氧化性特征。本申请以马尾松为研究对象，基于马尾松体胚发生过程中氧化还原特征，通过探讨氧化还原剂及相关信号物质对马尾松体胚成熟的影响，发现系统优化上述影响因素参数，为马尾松高效体胚育苗技术体系构建提供了有力的科技支撑。
[0018]本申请根据继代次数和增殖系数的研究实验，精确选取适合进行组织培养的马尾松胚性细胞；将马尾松的组织培养分成预培养、成熟培养和后熟培养三个步骤，然后通过筛选和优化，获取能有效还原清除ROS的还原剂，通过组分优化获得适合马尾松胚性细胞生长的预培养培养基、成熟培养基和后熟培养基，使得马尾松胚性细胞成熟效果显著改善形成了一套高效的马尾松体胚育苗技术体系。
【附图说明】
[0019]图1是连续继代增殖培养中马尾松胚性愈伤再生能力变化结果图。
[0020]图2是预培养处理下马尾松胚性细胞增殖培养效果图；图中，左图的对照组为常规增殖培养基培养的效果图，右图为添加活性氧清除剂处理后的增殖效果图。
[0021]图3是丁硫氨酸亚砜胺对马尾松胚性细胞成熟培养的影响结果图。
[0022]图4是丁硫氨酸亚砜胺处理下马尾松胚性细胞成熟培养效果对比图；图中，左图为未添加丁硫氨酸亚砜胺的对照组，右图为添加了0.4g/L丁硫氨酸亚砜胺的实验组。
[0023]图5是丁硫氨酸亚砜胺对马尾松成熟胚性细胞萌发的影响结果图。
[0024]图6是丁硫氨酸亚砜胺处理下马尾松成熟本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.马尾松胚性细胞培养基，其特征在于，所述培养基由预培养培养基、成熟培养基和后熟培养基组成；其中，预培养培养中包含50～100g/L的连二亚硫酸钠、1g/L的NiCl2·
6H2O和40～60mg/L的Nifedipine；成熟培养基和后熟培养基包含0.2～0.4g/L丁硫氨酸亚砜胺。2.根据权利要求1所述的马尾松胚性细胞培养基，其特征在于，所述预培养培养基还包括：DCR培养基、30g/L的蔗糖、3.5g/L的植物凝胶、2g/L的2,4
‑
D、0.5g/L的6
‑
BA、0.5g/L的酸水解酪蛋白和0.45g/L的谷胺酰胺；所述成熟培养基还包括：DCR培养基、60g/L蔗糖、4.5g/L植物凝胶、6g/LABA和0.5g/L谷胺酰胺；所述后熟培养基还包括：DCR培养基、15g/L的蔗糖、5.5g/L的植物凝胶、2.5g/L的活性碳、0.5g/L的GA和0.6g/L的NAA和0.5g/L的谷胺酰胺。3.应用如权利要求1或2任意一项马尾松胚性细胞培养基进行细胞成熟培养的方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚瑞玲，王胤，
申请(专利权)人：广西壮族自治区林业科学研究院，
类型：发明
国别省市：