一种负载化疗药物的灵芝多糖纳米粒制造技术

本发明专利技术属于生物制药领域，更具体地，涉及一种负载化疗药物的灵芝多糖纳米粒、其制备方法及应用。本发明专利技术公开了一种负载化疗药物的灵芝多糖纳米粒，其外层为灵芝多糖，内层为一种或多种化疗药物，DLS为120.6

【技术实现步骤摘要】
一种负载化疗药物的灵芝多糖纳米粒


[0001]本专利技术属于生物制药领域，更具体地，涉及一种负载化疗药物的灵芝多糖纳米粒、其制备方法及应用。

技术介绍

[0002]目前，化学治疗已和手术治疗、放射治疗成为恶性肿瘤不可或缺的重要治疗手段。临床化疗过程中，化疗药物强烈毒副作用，已成为肿瘤化学治疗最严重的障碍之一。
[0003]为止，人们已经尝试了多种方法努力克服化疗药物强烈毒副作用，包括使用纳米给药系统等，纳米给药系统可以提高抗肿瘤药物的疗效并降低其毒副作用，已有许多不同类型的纳米材料用于构建纳米给药系统，其中多糖作为纳米化的载体的研究工作有很多，大多数是基于壳聚糖、透明质酸、环糊精、纤维素等无免疫活性的多糖，这类多糖纳米给药系统可通过增强渗透和保留作用(EPR)效应在肿瘤组织滞留并富集，将药物尽量限制在肿瘤部位，在提高对肿瘤组织杀伤力的同时减少对正常组织的损伤。但人们对于理想的用于肿瘤治疗的药物递送系统的期望远不止如此。但这类多糖纳米给药系统都面临着：1、多糖载体不能帮助药物达到治疗的目的，通常载体都是惰性的，没有功能，起不到协同治疗肿瘤的目的；2、肿瘤转移的问题，肿瘤发生、生长、治疗过程中会发生转移，使癌症不易根治。
[0004]可见，如何从众多的备选材料中合理地进行选择，巧妙地构建出理想的载药系统，尤其是能协同抗肿瘤和肿瘤转移的载药系统并非一件易事，但却对肿瘤的有效治疗具有重要价值和意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种负载化疗药物的灵芝多糖纳米粒、其制备方法及应用。
[0006]本专利技术公开了一种负载化疗药物的灵芝多糖纳米粒，其外层为灵芝多糖，内层为一种或多种化疗药物，DLS为120.6
±
4.1nm～310.5
±
6.1nm、PDI为0.230～ 0.334、Zeta电位为
‑
14.4
±
0.41mV～
‑
10.2
±
0.24。
[0007]在另一优选例中，所述化疗药物选自紫杉醇、多西他赛、卡铂、顺铂、奥沙利铂、吉西他滨、卡培他滨、长春新碱、羟基喜树碱、多柔比星、阿霉素或丝裂霉素等；其中优选为阿霉素。
[0008]另一方面，本专利技术还公开上述负载化疗药物的灵芝多糖纳米粒的制备方法，包含下列步骤：
[0009](1)灵芝多糖纯化：灵芝多糖(GLP)溶解在超纯水中，经4％浓度的三氯乙酸除蛋白、80％乙醇除色素的预处理后，DEAE
‑
32纤维素阴离子交换柱对GLP 进行分离，先用高纯水做流动相洗脱出灵芝多糖中的中性多糖，然后用0.1M 氯化钠溶液作流动相洗脱，收集洗脱液酸性多糖；以0.2M氯化钠为流动相，将酸性多糖经过Sephacry S
‑
300HR凝胶柱分离，收集分子量较小且相对均一的多糖组分；浓缩，透析除盐，冷冻干燥，得到海绵状的粉末，即为
精制 GLP；
[0010](2)配制GLP溶液：称量精制GLP，溶于二甲基亚砜(DMSO)中，得到GLP溶液 A；
[0011](3)配制化疗药物溶液：称量化疗药物，溶于二甲基亚砜(DMSO)中，得到化疗药物溶液B；
[0012](4)纳米粒组装：将GLP溶液和化疗药物溶液按照一定的投料比至反应容器中，避光搅拌8h以上，得到载药纳米粒溶液C；
[0013](5)透析：将所得载药纳米粒子溶液C，装入截留分子量为7000Da的透析袋用去离子水透析24h
‑
48h，同时将有机溶剂体系置换成水体系；
[0014](6)超滤浓缩，冷冻干燥，得到载药GLP纳米粒。
[0015]在另一优选例中，所述化疗药物选自紫杉醇、多西他赛、卡铂、顺铂、奥沙利铂、吉西他滨、卡培他滨、长春新碱、羟基喜树碱、多柔比星、阿霉素或丝裂霉素等；其中优选为阿霉素。
[0016]在另一优选例中，所述GLP溶液和化疗药物溶液的投料比为5:2～1:1，优选为5:2。
[0017]另一方面，本专利技术还公开上述负载化疗药物的灵芝多糖纳米粒在制备治疗肿瘤药物中的用途。
[0018]本专利技术负载阿霉素的灵芝多糖纳米粒在提高药物稳定性、降低药物低毒性的同时实现缓释效果，具有明确的肿瘤细胞杀伤作用和抑制肿瘤转移作用。
附图说明
[0019]图1两种纳米粒的的表征。(A)Dox@DS和Dox@GLP的水合粒径及ζ电位；(B)Dox@DS和Dox@GLP的电镜图；(C)三种化合物的荧光发射波谱。
[0020]图2小鼠体重时间变化图。
[0021]图3各组肿瘤体积随时间变化曲线。
[0022]图4苏木精和伊红对肿瘤组织的染色，图中标尺为100μm。
[0023]图5肺转移性结节的定量分析。
[0024]图6 Dox@GLP对小鼠肝、心的毒性。(A)谷草转氨酶(AST)；(B)肌酸激酶同工酶(CK
‑
MB)。
具体实施方式
[0025]下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0026]实施例1.负载阿霉素的灵芝多糖纳米粒
[0027]1.1实验材料
[0028]灵芝多糖粗提取物(西安源森生物)，DEAE
‑
32阴离子交换树脂(北京鼎国)， Sephacryl S
‑
300HR(GE Healthcare)，DMSO、三乙胺、三氯乙酸、盐酸阿霉素购于Aladin，其余试剂均购于Sigma。
[0029]1.2实验方法
[0030]1.2.1灵芝多糖的分离与纯化
[0031]1.2.1.1蛋白和色素杂质的去除
[0032]①
精确称量10g灵芝粗多糖粉末，慢慢加至持续搅拌的80℃100mL水中，直至溶解完全。
[0033]②
将溶解完全的粗多糖水溶液冷却至室温。称取2g三氯乙酸固体加入溶液中，冰浴搅拌120min。然后静置60min，12000rpm离心10min，弃去沉淀，重复离心三次以彻底除去析出的不溶性沉淀，收集上清。
[0034]③
一边搅拌一边将上清液缓慢倒入到700mL的无水乙醇中(乙醇终浓度约 80％)，搅拌120min后，于4℃环境中静置过夜。
[0035]④
弃去上清收集沉淀，用无水乙醇反复洗涤值至上清无色，5000rpm离心 10min收集多糖沉淀，最后置于50℃鼓风干燥箱中使残留乙醇挥发完全，得到多糖粉末。
[0036]⑤
将多糖粉末完全溶解至20mL水中，利用离子交换层析和凝胶过滤层析进一步分离纯化。
[0037]1.2.1.2阴离子交换层析和凝胶过滤层析纯化
[0038]①
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种负载化疗药物的灵芝多糖纳米粒，其外层为灵芝多糖，内层为一种或多种化疗药物，DLS为120.6
±
4.1nm～310.5
±
6.1nm、PDI为0.230～0.334、Zeta电位为
‑
14.4
±
0.41mV～
‑
10.2
±
0.24。2.如权利要求1所述的灵芝多糖纳米粒，其特征在于所述化疗药物为紫杉醇、多西他赛、卡铂、顺铂、奥沙利铂、吉西他滨、卡培他滨、长春新碱、羟基喜树碱、多柔比星、阿霉素或丝裂霉素。3.如权利要求1所述的qPCR检测试剂盒，其特征在于所述化疗药物为阿霉素。4.如权利要求1
‑
3所述灵芝多糖纳米粒的制备方法，包含下列步骤：(1)灵芝多糖纯化：GLP溶解在超纯水中，经4％浓度的三氯乙酸除蛋白、80％乙醇除色素的预处理后，DEAE
‑
32纤维素阴离子交换柱对GLP进行分离，先用高纯水做流动相洗脱出灵芝多糖中的中性多糖，然后用0.1M氯化钠溶液作流动相洗脱，收集洗脱液酸性多糖；以0.2M氯化钠为流动相，将酸性多糖经过Sephacry S
‑
300HR凝胶柱分离...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘赟，王富军，张乐帅，王杨云，庞桂彬，喻欢，吴衍娴，
申请(专利权)人：上海中药标准化研究中心，
类型：发明
国别省市：