本发明专利技术公开了一种野生紫陀螺菌菌丝及其分离纯化方法，属于野生蘑菇菌丝分离纯化技术领域，野生紫陀螺菌的保藏编号为CGMCCNO.40193。该分离纯化方法通过种菇挑选和处理、组织分离培养、初期菌丝菌悬液制备、菌悬液液体发酵和单一菌丝球纯化培养等步骤。分离纯化得到野生紫陀螺菌菌丝，与传统方法相比，本发明专利技术保护范围内分离纯化得到的野生紫陀螺菌菌丝纯化成功率高，保证了初期菌丝的充分分离的同时，更有效、便捷、精准，促进了后续紫陀螺的保育促繁和人工繁育。陀螺的保育促繁和人工繁育。陀螺的保育促繁和人工繁育。
【技术实现步骤摘要】
一种野生紫陀螺菌菌丝及其分离纯化方法
[0001]本专利技术涉及野生紫陀螺菌菌丝分离纯化
，尤其涉及一种野生紫陀螺菌菌丝及其分离纯化方法。
技术介绍
[0002]紫陀螺菌又名“马蹄菌”，属担子菌亚门，非褶菌目，陀螺菌科，陀螺菌属。紫陀螺菌肉质脆嫩，味道鲜美，营养丰富，且易保鲜，易贮运，作为一种珍稀食用菌，紫陀螺菌在食品和药品领域具有很大的开发价值，但是由于紫陀螺菌的生物学特性仍不十分清楚，造成紫陀螺菌至今未被人工培育，野生紫陀螺菌的产量又因当地群众毁灭式采集而逐年降低，这严重威胁着野生紫陀螺菌物种的种群。
[0003]近年来，尽管有部分科技人员开展了对野生紫陀螺菌的菌丝分离、培养及液体发酵的研究，但紫陀螺菌子实体内部的细菌和真菌仍会极大的影响其菌丝的分离及培养，但是通过常规培养基进行培养后，多数分离的菌丝中仍然存在着长期伴生的真菌，这导致对紫陀螺菌进行分离和纯化很困难，成功率不高，即使分离出来，现有技术所获得的菌丝的纯化率也不高。因此在分离的过程中，培养基至关重要。紫陀螺菌的纯化率较低使得研究不能继续深入，如研究其细胞成分的物理、化学性质和变化以及这些性质和变化与生命现象的关系，而常规的生态学调查和培养基优化已难以探究清楚紫陀螺菌的生物学特性和生理代谢过程，成为了紫陀螺菌人工繁育的最大障碍，导致紫陀螺菌至今仍无法人工培育。
[0004]因此，在传统组织分离法的基础上，寻找一种更为有效、便捷、精准的野生紫陀螺菌的分离纯化方法对于野生紫陀螺菌的基础性研究十分重要，这也对后续紫陀螺菌的保育促繁和人工培育具有极为重要的意义。
技术实现思路
[0005]有鉴于此，本专利技术的目的是提供一种野生紫陀螺菌菌丝及其分离纯化方法，以解决野生紫陀螺菌的分离纯化中常带有伴生真菌，以至于紫陀螺菌的纯化成功率低的问题。
[0006]本专利技术通过以下技术手段解决上述技术问题：
[0007]一种野生紫陀螺菌菌丝，所述野生紫陀螺菌为陀螺菌属的真菌，分类学名称为Gomphus purpuraceus，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日为2022年05月23日，保藏编号为CGMCC NO.40193，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，其ITS序列如紫陀螺菌菌丝的序列1“紫陀螺菌菌丝的ITS序列”所示：
[0008]GGAAGGATCATTACAGTAGAGAAAAGGGGGGGTGCTGCGCTTTAGGCGCGGTGCGCGCCCTCCCGCCTTCTATTCCACATACACCGTGCACCTGATGGCGAGCGTCTCCCGTTCGGAGCCGCCTCGGGGGGGCCTTTTTGTGTTCCTCTGGGGCCGGGGCGCCCGTCTCCCAAACCGTTCACCGCAGCCTGTCAAACGCATGTCTTTTTTAATGGGCCTTACGGGGCAAGAAGCGTATAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTTTCGCATCGATGAAGAACGCCGCGAAAGTGCGAAACGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCATCTTGCGCTCCTTGGTATTCTGAGG
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[0009]一种野生紫陀螺菌菌丝的分离纯化方法的步骤为：
[0010](1)种菇挑选和处理：选取柱形期紫陀螺菌子实体作为种菇，对种菇进行消毒和晾干，并切成组织块；
[0011](2)组织分离培养：将组织块接入改良MMN固体培养基，将培养基进行封口后转入恒温培养箱培养，获得初期菌丝体；
[0012](3)初期菌丝菌悬液制备：将初期菌丝体和生理盐水混合装入无菌均质袋中进行均质，均质后获得菌悬液；
[0013](4)菌悬液液体发酵：将菌悬液接种在改良PDA+MMN综合液体培养基上，在振荡培养箱中以温度23
‑
25℃、振荡速率165r/min的条件振荡培养15
‑
20天，得到纯种紫陀螺菌菌丝球；
[0014](5)单一菌丝球纯培养：将培养得到的纯种菌丝球接种在改良PDA+MMN综合固体培养基中，恒温培养获得纯化菌丝。
[0015]进一步，所述(1)步骤中，种菇选用新鲜采摘的无开伞、无虫蛀，光滑直立，颜色由白渐变成紫色的柱形期紫陀螺菌子实体，用体积分数75％的医用酒精对紫陀螺菌种菇进行表面消毒，在无菌操作台面晾干后，使用医用无菌手术刀削除种菇表皮，将菌肉组织切成大小0.3cm
×
0.3cm的组织块。
[0016]优选地，菌肉组织选用柱形期基部1cm以上、顶部0.5cm以下的部分。
[0017]进一步，所述(2)步骤中，将组织块接入改良MMN固体培养基中，采用封口膜密封培养皿缝隙，转入恒温培养箱于20
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23℃环境下培养10
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15天即可获得初期菌丝体。
[0018]优选地，封口膜采用厚度0.2
‑
0.3μm，直径30mm的透气封口膜，以保证紫陀螺菌丝发育中对氧气的需求。
[0019]进一步，所述(3)步骤中，将初期菌丝体和0.85％的生理盐水装入12cm
×
18cm的无菌均质袋中，再使用速率为12.0次/秒的拍打式均质器均质10
‑
15min，即获得菌悬液。
[0020]当然地，制备菌悬液时，每块初期菌丝体加入的生理盐水量不少于20mL，优选用量为20mL生理盐水。
[0021]进一步，所述(4)步骤中，取制得的菌悬液于无菌条件下接入改良PDA+MMN综合液体培养基中，在振荡培养箱中以温度23
‑
25℃、振荡速率不小于165r/min的条件下振荡培养15
‑
20天，即可获得纯种紫陀螺菌菌丝球。
[0022]优选地，菌悬液接入改良PDA+MMN综合液体培养基中的接种量小于等于0.5mL。
[0023]优选地，液体培养基体积不超过广口三角瓶容积的1/3。
[0024]进一步，所述(5)步骤中，将培养的单个纯种紫陀螺菌菌丝球挑取至改良PDA+MMN综合固体培养基中，恒温23
‑
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【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种野生紫陀螺菌菌丝，其特征在于，所述野生紫陀螺菌菌丝为紫陀螺菌，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日为2022年05月23日，保藏编号为CGMCC NO.40193，其ITS序列如紫陀螺菌菌丝的序列1“紫陀螺菌菌丝的ITS序列”所示。2.一种野生紫陀螺菌菌丝的分离纯化方法，其特征在于，所述分离纯化方法的步骤为：(1)种菇挑选和处理：选取柱形期紫陀螺菌子实体作为种菇，对种菇进行消毒和晾干，并切成组织块；(2)组织分离培养：将组织块接入改良MMN固体培养基，将培养基进行封口后转入恒温培养箱培养，获得初期菌丝体；(3)初期菌丝菌悬液制备：将初期菌丝体和生理盐水混合后装入无菌均质袋中进行均质获得菌悬液；(4)菌悬液液体发酵：将菌悬液接种在改良PDA+MMN综合液体培养基上，在振荡培养箱中以温度23
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25℃、振荡速率165r/min的条件振荡培养15
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20天，得到纯种紫陀螺菌菌丝球；(5)单一菌丝球纯培养：将得到的纯种菌丝球接种在改良PDA+MMN综合固体培养基中，恒温培养获得纯化菌丝。3.根据权利要求2所述的一种野生紫陀螺菌菌丝的分离纯化方法，其特征在于，所述(1)步骤中，种菇选用新鲜采摘的无开伞、无虫蛀，光滑直立，颜色由白渐变成紫色的柱形期紫陀螺菌子实体，组织块用柱形期基部1cm以上、顶部0.5cm以下的菌肉组织部分切成。4.根据权利要求3所述的一种野生紫陀螺菌菌丝的分离纯化方法，其特征在于，所述(2)步骤中，将组织块接入改良MMN固体培养基中，采用封口膜密封培养皿缝隙，转入恒温培养箱于20
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23℃环境下培养10
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15天即可获得初期菌丝体。5.根据权利要求4所述的一种野生紫陀螺菌菌丝的分离纯化方法，其特征在于，所述(3)步骤中，将初期菌丝体和0.85％的生理盐水装入无菌均质袋中，再使用速率为12.0次/秒的拍打式均质器均质10
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15min，即获得菌悬液。6.根据权利要求5所述的一种野生紫陀螺菌菌丝的分离纯化方法，其特征在于，所述(4...
【专利技术属性】
技术研发人员：耿阳阳，张时馨，刘亚娜，胡伯凯，王纪辉，
申请(专利权)人：贵州省核桃研究所，
类型：发明
国别省市：
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