兰淡领瓶霉及其分离方法和应用技术

本发明专利技术微生物技术领域，具体公开一种兰淡领瓶霉及其分离方法和应用，本发明专利技术的一种兰淡领瓶霉YAFEF068菌株，该菌株由滇紫草根部分离获得；保藏名称为兰淡领瓶霉YAFEF068(Cadophora orchidicola YAFEF068)；保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是中国武汉大学；保藏日期：2022年6月8日；保藏编号CCTCC NO：M 2022841，本发明专利技术对多种致病细菌有显著的抑制作用，为研究开发新的抗细菌药物提供新的途径，缓解致病菌耐药性对人类健康构成的威胁。胁。胁。

【技术实现步骤摘要】
兰淡领瓶霉及其分离方法和应用


[0001]本专利技术微生物
，具体涉及一种兰淡领瓶霉及其分离方法和应用。

技术介绍

[0002]内生真菌是指生活史的某一个阶段能侵染定殖在健康植物组织内部，且 不会引起宿主植物明显病症的一类真菌。包括那些在其生活史的某一阶段营 表生的腐生菌，以及对宿主植物暂时没有伤害的潜伏性病原菌和菌根真菌。 内生真菌种类多，广泛存在于各种类型的植中，有些可以促进植物生长及显 著提高寄主植物的抗逆能力，包括抗生物逆境和非生物逆境的能力。而植物 体为真菌提供生长、栖息的保护场所，作为回报，真菌合成一些次生代谢产 物用于促进植物的生长及防御。而这些次生代谢产物中有些则极具新药开发 前景。随着现代化进程的加快，全球性的环境污染也随之加剧，由致病细菌、 真菌引起的各种疾病极大地威胁着人类的健康。为了降低化学合成药物带来 的毒副作用，人们一直热衷于从药用植物中研制天然药物。
[0003]滇紫草(Onosma paniculatum)属紫草科、滇紫草属的多年生草本植物， 主要分布在中国四川西部至西南部、云南西北部至中部及贵州西部，生长于 海拔2000～3200米干燥山坡及松栎林林缘及向阳山坡草丛中。以其根状茎入 药，含乙酰紫草醌、异丁酰紫草醌、β,β
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二甲基丙烯紫草醌、β
‑
羟基异 戊酰紫草醌、3,4
‑
二甲基戊烯
‑3‑
酰基紫草醌等多种化合物，具有抗菌、消 炎、抗肿瘤，促进血液心脏循环系统等作用。
[0004]目前对滇紫草(Onosma paniculatum)内生真菌的研究未有报道。

技术实现思路

[0005]本专利技术主要目的是提供了一株抗细菌活性强的兰淡领瓶霉，另外本专利技术 还提供了该菌株的分离方法和应用。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术通过如下技术方案实现：本专利技术的一株抗细 菌活性强的兰淡领瓶霉YAFEF068，该菌株由滇紫草根部分离得到；保藏名称 为兰淡领瓶霉YAFEF068(Cadophora orchidicola YAFEF068)；保藏于中国 典型培养物保藏中心，保藏地址是中国武汉大学；保藏日期：2022年6月8 日；保藏编号：CCTCC NO：2022841。
[0007]进一步的，所述菌株的ITS基因序列为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
[0008]本专利技术还提供一种菌剂，包括兰淡领瓶霉YAFEF068的培养物或其加工 物。
[0009]进一步的，菌剂包括：兰淡领瓶霉YAFEF068菌丝体粗提物、超声裂解 上清或超声裂解沉淀。
[0010]进一步的，所述兰淡领瓶霉YAFEF068培养所使用的培养基为ZMMM固体 培养基。
[0011]优选的，所述ZMMM固体培养基包括玉米粉8g/瓶，MM液体培养基15mL/ 瓶，混匀至350mL组培瓶中，所述MM液体培养基包括：硝酸钠6g/L，氯化 钾0.52g/L，七水硫酸镁0.52g/L，磷酸二氢钾1.52g/L。
[0012]进一步的，本专利技术提供了兰淡领瓶霉YAFEF068菌株及用其制备的菌剂 在制备抑
orchidicola YAFEF068)；d.二甲亚砜)。
[0030]图8为本专利技术的YAFEF068菌株对枯草芽孢杆菌的抑制作用图，(注a.纯 培养基(ZMMM固体培养基)；b.ZMMM固体培养基(Cadophora sp.)；c.ZMMM 固体培养基(Cadophora orchidicola YAFEF068)；d.二甲亚砜)。
[0031]图9为本专利技术的YAFEF068菌株对福氏志贺氏菌的抑制作用图，(注a.纯 培养基(ZMMM固体培养基)；b.ZMMM固体培养基(Cadophora sp.)；c.ZMMM 固体培养基(Cadophora orchidicola YAFEF068)；d.二甲亚砜)。
[0032]图10本专利技术的YAFEF068菌株系统进化树图。
具体实施方式
[0033]本专利技术结合附图和具体实施例作进一步说明。应该理解，这些实施例仅 用于说明目的，而不用于限制本专利技术范围。
[0034]实施例1
[0035]如图6至图9所示，本专利技术筛选得到兰淡领瓶霉YAFEF068，保藏于中国 典型培养物保藏中心，该菌株是从滇紫草根部分离、纯化得到。该菌株保藏 名称为兰淡领瓶霉YAFEF068(Cadophora orchidicola YAFEF068)，保藏于 中国典型培养物保藏中心，保藏地址是中国武汉大学；保藏编号：CCTCC NO： M2022841。该培养物于2022年06月08日由保藏中心收到，并登记入册， 由该日起保存三十年，在期满前收到提供培养物样品的请求后再延续保存五 年，该培养物的存活性由保藏中心于2022年06月15日检测完毕，结果为 存活。
[0036]YAFEF068菌株在PDA培养基上生长良好，中间菌丝体呈现黑色，边缘菌 丝体颜色为白色，菌丝呈放射状向周围生长呈絮状，且较密集，菌落呈规则 的圆形状。其菌株培养的菌丝体粗提物对蜡样芽孢杆菌、无乳链球菌、枯草 芽孢杆菌、福氏志贺氏菌等致病细菌都具有较好的抗细菌活性。为缓解致病 菌耐药性对人类健康构成的威胁，研究开发新的抗细菌药物提供新的途径。
[0037]YAFEF068菌株的分离和鉴定
[0038]1、YAFEF068菌株的分离
[0039]先用自来水冲洗滇紫草根部24h，然后转入超净工作台，先用1L无菌水 冲洗，后用小刀切成0.5cm组织块。将切好的组织块放于50mL离心管，倒 入不同配比乙醇充分消毒，用灭菌水冲洗干净置于无菌滤纸吸干水分，晾干 备用。取组织块等距离分别放在含有50ug/mL氨苄青霉素和卡那霉素的PDA 培养基上，每个培养皿放置8个组织块，把培养皿做好标记，将培养皿倒置 放于27℃培养箱中培养，培养8d左右，期间不定期观察。待培养基中菌丝 长满，把菌丝转接到PDA培养基，培养8d，将所挑取的菌株进行后续分子鉴 定后得到兰淡领瓶霉YAFEF068。
[0040]PDA培养基包括：马铃薯粉5g/L、KH2PO41g/L、MgSO40.5g/L、葡萄糖20g/L、 酵母粉5g/L、VB10.1g/L、琼脂16g/L。
[0041]2、滇紫草根部内生真菌的鉴定
[0042](1)形态的鉴定
[0043]真菌在PDA培养基上生长良好，菌丝前期白色呈放射状向周围生长，菌 丝较密集，且菌层较厚，菌落呈规则的圆形状，生长到后期呈黑色。
[0044](2)DNA提取
[0045]实验前先打开水浴锅，用于CTAB预热；取滇紫草根部内生真菌分离纯 化培养的菌丝体置于装有钢球的2mL离心管中，并将离心管放到装有液氮的 不锈钢罐中浸泡6min，用细胞匀浆破碎机破碎1min，直至将菌丝体打碎； 移离心管至通风出加入1mL的CTAB、200uL PVP和20uLβ
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巯基乙醇，摇匀 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种菌株，其特征在于，该菌株名称为兰淡领瓶霉YAFEF068(Cadophora orchidicola YAFEF068)，保藏编号为CCTCC NO：M2022841。2.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于：所述菌株的ITS基因序列为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。3.一种菌剂，其特征在于，包括权利要求1或2所述兰淡领瓶霉YAFEF068的培养物或其加工物。4.根据权利要求3所述菌剂，其特征在于，包括：兰淡领瓶霉YAFEF068菌丝体粗提物、超声裂解上清或超声裂解沉淀。5.根据权利要求3所述的菌剂，其特征在于，所述兰淡领瓶霉YAFEF068培养所使用的培养基为ZMMM固体培养基。6.根据权利要求5所述的菌剂，其特征在于，所述ZMMM固体培养基包括玉米粉8g/瓶，MM液体培养基15mL/瓶，混匀至350mL组培瓶中，所述MM液体培养基包括：硝酸钠6g/L，氯化钾0.52g/L，七水硫酸镁0.52g/L，磷酸二氢钾1.52g/L。7.根据权利要求1
‑
2任一所述的兰淡领瓶霉YAFEF068菌株或权利要求4
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5任一所述的菌剂在制备抑制致病细菌的药物中的应用。8.根据权利要求6所述的应用，所述致病细菌为蜡样芽孢杆菌、无乳链球菌、枯草芽孢杆菌或福氏志贺氏菌。9.根据权利要求1

【专利技术属性】
技术研发人员：王毅，余姣君，
申请(专利权)人：黄冈师范学院，
类型：发明
国别省市：