用于合成核酸的可重复使用的起始子制造技术

本发明专利技术提供了用于使用偶联到固相载体的可再生起始子合成如DNA和RNA等多核苷酸的改进方法。使用本发明专利技术的方法，可以在不使用核酸模板的情况下在水性环境中逐个碱基地从头合成多核苷酸的特定序列。成多核苷酸的特定序列。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于合成核酸的可重复使用的起始子
[0001]相关申请
[0002]本申请要求于2020年4月6日提交的美国申请第16/841,214号的权益和优先权，该美国临时申请的内容通过引用并入本文。


[0003]本专利技术涉及合成具有期望的序列且不需要模板的多核苷酸的方法和设备。

技术介绍

[0004]大多数从头核酸测序是使用成熟的固相亚磷酰胺技术进行的。亚磷酰胺技术涉及对由亚磷酰胺试剂构建的序列进行顺序脱保护和合成，该试剂对应于天然(或非天然)核酸碱基。然而，亚磷酰胺核酸合成是有长度限制的，因为长度超过200个碱基对(bp)的核酸会有很高的断裂率和副反应。另外，亚磷酰胺合成会产生有毒副产物，此废物的处置限制了核酸合成器的可用性，并且增加了合同寡核苷酸生产的成本。(据估计，每年对寡核苷酸合成的需求造成了超过300,000加仑的危险化学废物，包含乙腈、三氯乙酸、甲苯、四氢呋喃和吡啶)。参见LeProust等人,《核酸研究(NucleicAcidsRes.)》,第38(8)卷,第2522
‑
2540页,(2010)，该文献通过引用以其整体并入本文)。因此，需要更有效并且更具成本效益的寡核苷酸合成方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供改进的核酸合成方法。本专利技术的方法提供更快、更长的多核苷酸从头合成。如此，本专利技术极大地降低了定制核酸合成的总体成本。本专利技术的方法是针对多核苷酸的模板非依赖性合成，通过使用核苷酸基转移酶加入核苷酸类似物，通过可切割连接子偶联到抑制因子。由于存在抑制因子，合成因添加每一新的碱基而停顿，因此连接子发生切割，从而分离抑制因子并且离开多核苷酸，这与天然产生的核苷酸本质上相同(即，通过酶识别为进一步核苷酸并入的底物)。
[0006]具体地，本专利技术提供了一种用于模板非依赖性核酸合成的可再生底物。从头合成始于与固相载体结合的核酸起始子。在存在合适的酶(例如聚合酶，例如末端脱氧核苷酸基转移酶(TdT))的情况下，将核苷酸类似物添加到核酸起始子中以产生寡核苷酸。优选的是，核苷酸类似物包含可去除的封端基团，该基团在添加一个核苷酸后导致酶添加停止。可去除的封端基团可以与核酸的碱基部分和/或与核酸的3'羟基连接。封端基团和/或3'封闭基团的解封会产生新活性位点，该活性位点是酶的底物。随着随后添加新核苷酸或核苷酸类似物，寡核苷酸延伸。
[0007]在一些情况下，核酸起始子包括作为酶底物的3'部分。释放剂用于分离3'部分，从而释放寡核苷酸。3'部分、核酸起始子和固相载体在初生寡核苷酸释放后可重复使用。
[0008]本专利技术另外包含利用本专利技术方法产生定制多核苷酸的设备。本专利技术的设备包含提供一个或多个水性条件的生物反应器和多个核苷酸类似物来源。生物反应器可以为例如储
槽、流槽或多孔板。生物反应器可以包含具有核酸起始子和可切割3'部分的固相载体。从固相载体开始，多核苷酸在反应器中生长，通过核苷酸基转移酶的自然活性添加连续核苷酸，例如末端脱氧核苷酸基转移酶(TdT)或任何其它无模板方向拉长DNA或RNA链的酶。连接子切割后，从固相载体中释放出天然多核苷酸。序列完成后，载体被剥离，或3'部分与释放剂接触，留下与自然界中发现的多核苷酸基本相同的多核苷酸。在一些实施例中，将设备设计为通过在核苷酸添加之后回收溶液并且将溶液再用于子序列核苷酸添加来回收核苷酸类似物溶液。因此，与最先进的方法相比，产生的废物更少，每碱基的总成本也更低。在某些实施例中，生物反应器可以包含微流体装置和/或使用喷墨印刷技术。
[0009]封端基团可以包含(例如)带电部分或空间抑制因子。通常，阻止核苷酸基转移酶实现功能构象的大分子可用于抑制寡核苷酸合成。此类大分子包含聚合物、多肽、类多肽和纳米颗粒。大分子应该足够大以从物理上阻止接近核苷酸基转移酶的活性位点，但又不会大到对反应动力产生不利改变。如下文所述，使用各种连接子中的任何一种将大分子与核苷酸类似物连接。
[0010]在使用3'
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O
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封闭核苷酸类似物的实施例中，3'
‑
O封闭基团通常较小且容易去除，因此允许与具有修饰的活性位点的工程化酶一起使用。例如，3'
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O
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封闭基团可以包括叠氮甲基、氨基或烯丙基。
[0011]在一些实施例中，寡核苷酸合成可以包含在每次核苷酸类似物添加之后，但在切割封端基团之前，向一个或多个合成的寡核苷酸引入3'核酸外切酶。封端基团阻止3'核酸外切酶作用于添加了核苷酸类似物的任何寡核苷酸，而未成功添加含有终止子的类似物的寡核苷酸被3'核酸外切酶去除。以这种方式，本专利技术使得能够进行制程质量控制并且可以消除对合成后纯化的需要。
[0012]本专利技术的其它方面将在考虑以下图式和具体实施方式后而为所属领域的技术人员所显而易知。
附图说明
[0013]图1A示出了一类脱氧胞苷三磷酸(dCTP)类似物，这些类似物具有在N
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4位置处连接的可切割终止子；
[0014]图1B示出了从图1A的dCTP类似物切割可切割终止子以获得“天然”dCTP和环状离去分子；
[0015]图2A示出了一类脱氧腺苷三磷酸(dATP)类似物，这些类似物具有在N
‑
6位置处连接的可切割终止子；
[0016]图2B示出了从图2A的dATP类似物切割可切割终止子以获得“天然”dATP和环状离去分子；
[0017]图3A示出了一类脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)类似物，这些类似物具有在N
‑
2位置处连接的可切割终止子；
[0018]图3B示出了从图3A的dGTP类似物切割可切割终止子以获得“天然”dGTP和环状离去分子；
[0019]图4A示出了一类脱氧胸苷三磷酸(dTTP)类似物，这些类似物具有在N
‑
3位置处连接的可切割终止子；
[0020]图4B示出了从图4A的dTTP类似物切割可切割终止子以获得“天然”dTTP和环状离去分子；
[0021]图5A示出了一类脱氧尿苷三磷酸(dUTP)类似物，这些类似物具有在N
‑
3位置处连接的可切割终止子；
[0022]图5B示出了从图5A的dUTP类似物切割可切割终止子以获得dUTP和环状离去分子；
[0023]图6示出了示例性脱氧胞苷三磷酸(dCTP)类似物，其具有使封闭Asp
‑
Asp分子连接到脱氧胞苷的N
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4位的施陶丁格(Staudinger)连接子并且随后在水性条件下使施陶丁格连接子切割以获得dCTP和离去基团；
[0024]图7A示出了一种胞嘧啶核苷三磷酸(rCTP)类似物，该类似物具有在N
‑
4位置处连接的可切割终止子；
[0025]图7B示出了从图7A的rCTP类似物切割可切割终止子以获得“天然”rCTP和环状离去分子；
[0026]图8A示出了一种腺苷三磷酸(rA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于合成寡核苷酸的方法，所述方法包括：在存在核苷酸基转移酶并且不存在核酸模板的情况下，在足以将核苷酸类似物并入与固相载体连接的寡核苷酸的条件下将所述寡核苷酸暴露于所述类似物，其中所述核苷酸类似物包括3'
‑
O
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封闭基团，所述封闭基团阻止所述核苷酸基转移酶催化将天然核苷酸或核苷酸类似物添加到所述寡核苷酸中，直到所述封闭基团被去除；以及在去除所述3'
‑
O
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封闭基团之前，将所述寡核苷酸暴露于具有3'
‑
5'核酸外切酶活性的酶。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述核苷酸类似物结构包括：其中，BG是选自由以下组成的组的3'
‑
O
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封闭基团：3'
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ONO2、3'
‑
OCH2CH2CN、3'
‑
OCH2N3、3'
‑
OPO3、3'
‑
OCH2SSCH3和3'
‑
ONHC(O)H；并且R选自由以下组成的组：H、酰胺、氨基甲酸酯和尿素，在每种情况下任选地与选自由以下组成的组的成员连接：甲基、乙基、丙基、异丙基、异丁基、新戊酰基、环己基、环丙基、苯基、萘基、蒽基、菲基、芘基、苣基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、吲哚基、喹啉基、异喹啉基、呋喃基、噻吩基、吗啉基、哌啶基、二噁烷基、四氢呋喃基和生物素。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述核苷酸类似物包括以下结构：其中，BG是选自由以下组成的组的3'
‑
O
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封闭基团：3'
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ONO2、3'
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OCH2CH2CN、3'
‑
OCH2N3、3'
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OPO3、3'
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OCH2SSCH3和3'
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ONHC(O)H；并且核苷酸
‑
R选自由以下组成的组：脱氧腺苷、脱氧胞苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷、N6修饰的脱氧腺苷、N4修饰的脱氧胞苷、N1修饰的脱氧胸苷、O6修饰的脱氧鸟苷、N1修饰的脱氧鸟苷和N2修饰的脱氧鸟苷。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述具有3'
‑
5'核酸外切酶活性的酶选自由以下组成的组：ExoI、热不稳定ExoI和ExoT、Exo I、Exo T、热不稳定Exo I、Exo II、Exo III、Exo IV、Exo V、Exo VII、Exo IX、Exo
‑
IX、TREX1、TREX2 RNA酶T、Pol d、Pol e、Pol g、POL3、POL2、MIP1、WRN、p53、MRE11、hRADl、RADI、hRAD9和Rad9。5.根据权利要求3所述的方法，其中核苷酸
‑
R选自由以下组成的组：N4修饰的脱氧胞苷、O6修饰的脱氧鸟苷、N1修饰的脱氧鸟苷和N2修饰的脱氧鸟苷。6.根据权利要求3所述的方法，其中核苷酸
‑
R选自由以下组成的组：N4修饰的脱氧胞苷
和N1修饰的脱氧胸苷。7.根据权利要求3所述的方法，其中核苷酸
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R选自由以下组成的组：N4修饰的脱氧胞苷和N6修饰的脱氧腺苷。8.根据权利要求3所述的方法，其中核苷酸
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R选自由以下组成的组：O6修饰的脱氧鸟苷、N1修饰的脱氧鸟苷、N2修饰的脱氧鸟苷、N6修饰的脱氧腺苷和N1修饰的脱氧胸苷。9.一种用于合成寡核苷酸的方法，所述方法包括：a)在存在核苷酸基转移酶并且不存在核酸模板的情况下，在足以将核苷酸类似物并入与固相载体连接的寡核苷酸的条件下将所述寡核苷酸暴露于所述类似物，其中所述核苷酸类似物包括3'
‑
O
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封闭基团，所述封闭基团阻止所述核苷酸基转移酶催化将天然核苷酸或核苷酸类似物添加到所述寡核苷酸中，直到所述封闭基团被去除，b)在去除所述3'
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封闭基团之前，将所述寡核苷酸暴露于...

【专利技术属性】
技术研发人员：S，
申请(专利权)人：分子组装公司，
类型：发明
国别省市：