一种提取动物乳汁中乳脂球RNA的方法技术

本发明专利技术涉及一种提取动物乳汁中乳脂球RNA的方法，将步骤简化为预处理、裂解、分层、醇沉、洗涤、干燥、溶解。本发明专利技术通过增加预处理奶样步骤，采用DEPC原液混合奶样以及液氮速冻奶样，DEPC可以与多个核酸酶基团发生反应，从而破坏RNA酶的活性，液氮温度大约为

【技术实现步骤摘要】
一种提取动物乳汁中乳脂球RNA的方法


[0001]本专利技术涉及分子生物学中RNA提取方法领域，具体涉及一种提取动物乳汁中乳脂球RNA的方法。

技术介绍

[0002]乳以及乳制品是人类日常补充蛋白质、维生素等营养物质的重要来源。随着人类的经济发展，对高质量生活有了更高的要求，对乳制品的消费快速增长，对乳制品的质量要求不断提高。因此，研究动物泌乳性状的形成机制对提高乳汁产量和质量具有重要的经济价值，同时也对品种改良、分子育种等都具有重要意义。
[0003]乳腺是乳汁合成及分泌的场所，也是研究泌乳机制的直接材料。然而，活体采集乳腺通常会破坏动物的乳房组织，这会导致具有优秀乳用价值的动物出现乳腺炎症及多种并发症，且面临生产性能下降的巨大风险。在屠宰场采集已宰杀动物的乳腺虽然不影响生产性能，但是采集的动物通常是已经淘汰的家畜，其各方面生产数据难以获得，且泌乳性能已经下降，无法代表优秀泌乳性状的基因表达特征。
[0004]乳脂球是乳脂合成及代谢过程最直接的参与者，分离提取乳脂球中的RNA以研究优秀泌乳性状的基因表达模式是一种可以代替乳腺的无创性检测方法，为研究动物泌乳性状及其相关机制提供参考。
[0005]目前，国内外关于动物乳汁中乳脂球RNA提取的方法的报道还比较少，一般采用RNA试剂盒和传统Trizol法提取。但是由于乳脂球处于动物的乳汁中受液体的影响易降解，以及乳汁里面乳脂球样本量少、不易分离，所以采用试剂盒法提取会出现RNA浓度低、质量差等情况，且目前市面上没有适用于提取哺乳动物乳脂球RNA的试剂盒。而与市面上流通的商品化试剂盒及其它RNA提取方法相比，Trizol法的裂解能力、去蛋白能力更强，具有普遍适用性，以Trizol法更适合提取哺乳动物乳脂球RNA。Trizol法提取RNA原理是，在匀质化样品中，Trizol试剂既可以保持RNA的完整性，同时又能破坏细胞及溶解细胞成分。加入氯仿离心后，分层为水相和有机相，RNA存在于水相中。分离水相，通过加入异丙醇转为沉淀回收。最后通过洗涤、干燥、溶解，即可获得RNA。但在我们前期提取乳脂球RNA的实践中发现，由于Trizol、氯仿、异丙醇等有机溶剂的使用，会导致RNA中的多糖、酚类物质残存量大，且传统Trizol法操作步骤繁杂、操作时间长，在提取过程还可能存在内源性RNA酶降解RNA等，这些问题会导致提取出来的乳脂球RNA质量不佳，完整度不高，不能进行后续的测序建库等工作。

技术实现思路

[0006]为了解决以上问题，本专利技术提出一种提取动物乳汁中乳脂球RNA的方法。
[0007]本专利技术提供的提取动物乳汁中乳脂球RNA的方法，包括如下步骤：
[0008]步骤一：取泌乳期动物的乳汁，装入含有DEPC原液的离心管中，所述DEPC原液与乳汁的体积比为1：1000，将离心管底部放入液氮中冷却5
‑
10秒，快速抽离，上下剧烈摇晃，使
其温度快速下降，重复以上操作，待离心管中的乳汁出现少量冰晶后，停止操作；
[0009]步骤二：将上述离心管放入4℃离心机中离心，参数设置为12000r/min、10min；
[0010]步骤三：离心后将离心管转移至
‑
20℃冰箱中，冷冻5min；
[0011]步骤四：将上述冷冻后的离心管在超净台上分离出600
‑
800μg乳脂，置入已提前预冷并加入600μL Trizol的离心管中，并且上下剧烈摇晃，冰浴静置5min；在冰浴过程中每隔1min上下剧烈摇晃一次；冰浴完成后放入4℃
[0012]离心机中离心，参数设置12000r/min、10min；观察到Trizol上层还有一层透明的油脂层，移除该油脂层；
[0013]步骤五：将300μL提前预冷好的氯仿加入上述已分离去除油脂层的离心管中，冰浴静置5min，在冰浴过程中每隔1min上下剧烈摇晃一次；然后放入4℃离心机中离心，参数设置12000r/min、15min；
[0014]步骤六：取上述离心管中的上清液，加入到另一管新的离心管中，并且
[0015]加入与上清液体积比为1：1的预冷好的异丙醇；上下轻柔的摇晃几次，冰浴8min，在冰浴过程中每隔2min上下轻柔的摇晃一次；然后放入4℃离心机中离心，参数设置10000r/min、10min；
[0016]步骤七：移除上述离心管中的上清液，加已预冷好的1mL 75％乙醇冲洗沉淀部分，冰浴1min；然后放入4℃离心机中离心，参数设置8000r/min、4min；
[0017]步骤八：移除上述离心管中的上清液，大风吹，待沉淀由白色变成周围透明中间乳白色，停止大风吹，加入15
‑
80μL的DEPC水，用移液枪吹打混匀则完成乳脂球RNA的提取。
[0018]进一步，所述的Trizol试剂、氯仿、异丙醇、75％乙醇、DEPC水均提前放入
‑
20℃预冷。
[0019]进一步，上述步骤中移除上清液应使用已剪过枪头的移液枪进行操作。
[0020]进一步，所述75％乙醇为无水乙醇与DEPC水以体积比为3：1的比例进行配置，现配现用，提前预冷10min以上。
[0021]进一步，所述DEPC水的配方为：DEPC原液与三蒸水体积比为1：1000，
[0022]分装至无菌无RNA酶离心管中，混匀。
[0023]本专利技术的有益效果如下：
[0024]1、基于乳脂球的特殊性和传统Trizol法的短板，本专利技术的提取动物乳汁中乳脂球RNA的方法，克服了现有方法的缺陷，优化了提取时间和提取步骤，最大化的抑制了RNA降解。适用于所有哺乳类动物乳汁中乳脂球RNA的提取，且操作简单、经济实惠、结果可靠，提取出的RNA，可用于后续的基因表达水平检测或测序建库等工作。
[0025]2、本专利技术增加预处理奶样步骤。由于乳脂球处于乳液中，受液体影响在取样运输过程中就易降解，为了解决这问题，本专利技术采用DEPC原液混合奶样以及液氮速冻奶样。DEPC可以与多个核酸酶基团发生反应，从而破坏RNA酶的活性。液氮温度大约为
‑
196℃，可以使奶样瞬间达到低温状态，抑制了乳液中内源性RNA酶对乳脂球的降解，从而起到保护乳脂球RNA的作用。通过低温高速离心机分离法，分离出乳脂层加入Trizol中，混匀再次采用低温离心，弃上层多余油脂层。操作过程简单，可以解决乳中乳脂球不易分离、油脂等杂质含量高的问题，获得完整的乳脂层，以便后续的提取实验。
[0026]3、本专利技术的操作步骤以及操作时间得到最优化，将步骤简化为预处理、裂解、分
层、醇沉、洗涤、干燥、溶解。将裂解和醇沉时间都控制在15
‑
20分钟，其他步骤时间缩短，目的是为了收集更多的乳脂球RNA，以及尽量将所有乳脂球RNA转化为沉淀形式，合理化利用时间，缩短了不必要的操作时间，防止乳脂球RNA在操作过程中因时间过长而降解。
[0027]4、本专利技术解决了采用传统Trizol提取本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提取动物乳汁中乳脂球RNA的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一：取泌乳期动物的乳汁，装入含有DEPC原液的离心管中，所述DEPC原液与乳汁的体积比为1:1000，将离心管底部放入液氮中冷却5
‑
10秒，快速抽离，上下剧烈摇晃，使其温度快速下降，重复以上操作，待离心管中的乳汁出现少量冰晶后，停止操作；步骤二：将上述离心管放入4
°
C离心机中离心，参数设置为12000r/min、10min；步骤三：离心后将离心管转移至
‑
20
°
C冰箱中，冷冻5min；步骤四：将上述冷冻后的离心管在超净台上分离出600
‑
800μg 乳脂，置入已提前预冷并加入600μL Trizol的离心管中，并且上下剧烈摇晃，冰浴静置5min；在冰浴过程中每隔1min上下剧烈摇晃一次；冰浴完成后放入4
°
C离心机中离心，参数设置12000r/min、10min；观察到Trizol上层还有一层透明的油脂层，移除该油脂层；步骤五：将300μL提前预冷好的氯仿加入上述已分离去除油脂层的离心管中，冰浴静置5min，在冰浴过程中每隔1min上下剧烈摇晃一次；然后放入4
°
C离心机中离心，参数设置12000r/min、15min；步骤六：取上述离心管中的上...

【专利技术属性】
技术研发人员：李志鹏，蒋晗偲，郑雅琳，刘庆友，崔奎青，任红贺，王书婉，李玲，龚慧超，
申请(专利权)人：皇氏赛尔生物科技广西有限公司，
类型：发明
国别省市：