一种基因突变原位成像方法技术

本发明专利技术公开了一种利用点亮RNA适配体的单碱基突变成像方法，属于细胞内基因原位检测领域。通过连接酶辅助转录反应实现对单核苷酸位点变异（SNV）的识别，使用点亮的RNA适配体作为报告体，消除了非特异性探针结合和清洗过程，与使用荧光原位杂交方法相比，信号显著提高。因此，本发明专利技术可以精确定量细菌混合物中的耐药菌株，并鉴定从家禽养殖场分离出的耐药沙门氏菌。菌。菌。

【技术实现步骤摘要】
一种基因突变原位成像方法


[0001]本专利技术属于细胞内基因原位检测领域，涉及一种基于转录放大的单核酸变异点亮策略，实现了单细胞单核算变异的免洗和高对比度成像，并且避免了非特异性探针的结合。本专利技术可对突变的耐药菌株进行检测。

技术介绍

[0002]由于抗生素的过度使用，耐药性突变的病原菌得到保留，食源性耐药性病原菌所带来的食品安全问题愈发严重，因此，寻找出一种可以对耐药菌精确定量的方法已迫在眉睫。
[0003]基于PCR或测序的遗传变异分析极大地促进了我们对单核苷酸变异（SNVs）在生理和病理状态中的作用 的理解，其中一些SNVs已被确定为癌症和传染病等疾病的关键生物标志物。然而，这些基于多细胞样本的批量方法只揭示了一般的遗传变异和少数细胞的特征。荧光原位杂交技术(FISH)成为亚细胞和组织尺度上基因表达图谱的一种广泛可用的工具。相比之下，在细胞背景下成像SNV的方法可以用单细胞分辨率提供细胞异质性和种群的空间信息。但是，SNV成像受到单核苷酸分辨率要求下产生高水平信号的障碍的挑战。为了产生高增益的细胞成像，多荧光团修饰探针通常用于靶RNA标记。因此，FISH不能检测短RNA序列，从而不能检测RNA中的SNV特征。无论是否与核酸扩增耦合，FISH都不可避免地伴随着非特异性探针与细胞结构或成分的结合，因为它依赖于荧光团标记探针的杂交。非特异性探针结合将导致高背景和衰减信号增益，需要严格的清洗过程来缓解背景。
[0004]故本专利技术采用一种无背景的SNV成像策略，使用发光RNA适配体作为标记探针，实现细胞内SNVs检测的免冲洗和高对比度成像。本专利所提供的方法可以对沙门氏菌耐药菌株进行了精确定量，使我们能够可视化沙门氏菌在小鼠肠道中的SNV，从而研究耐药和药敏沙门氏菌的定殖特征，并筛选益生元抑制沙门氏菌定殖。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，探索一种基于连接触发转录和发光适配体实现单细胞中SNVs的无冲洗和高对比度成像的耐药病原菌基因可视化原位检测方法，通过设计一对分裂探针来识别SNVs，并将其作为转录模板。其中SNVs在这对分裂探针的杂交缺口位点上。而后，DFHBI
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1T染料通过与转录出的Broccoli RNA结合而产生荧光，点亮细胞内的SNV。 该方法可以消除了非特异性探针结合和洗涤过程，极大地减少了背景，简化了成像协议。并且，该方法对带有SNVs的序列图像有较高的增益，可用于肠道等高背景组织切片。
[0006]本专利技术所述的单细胞原位检测方法的具体步骤如下：（1）转录扩增成像。细菌固定后，进行探针杂交、连接和转录反应。在离心管内加入一定体积的Probe L (10 μM)、Probe R (10 μM)、promoter (10 μM)、20
×
SSC buffer、DTT (100 mM)、RiboLock RNase Inhibitor (40 U/ μL)、酵母tRNA (10 mg/mL)、甲酰胺和RNase
‑
free H2O，使探针与细胞
mRNA在37 ℃的条件下杂交过夜。用1
×
PBS缓冲液在室温下清洗两次后，向其中添加T4 DNA连接酶，10
×
T4 DNA连接酶缓冲溶液和水反应1 h，以连接Probe L和Probe R。而后向其中加入phi 29 DNA聚合酶，dNTPs，10
×
phi 29 DNA聚合酶反应缓冲溶液和水在37 ℃下反应1 h。用1
×
PBS缓冲液冲洗一次后，添加T7 RNA聚合酶，10
×
T7 RNA聚合酶缓冲溶液，rNTPs，水在37℃条件下孵育12 h。加入DFHBI
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1T溶液(10 mM)与RNA适配体broccoli结合。荧光图像采用尼康Ts2R
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FL倒置显微镜。激发波长为490
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510 nm，发射波长为520
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550 nm。（2）荧光检测。首先，将RNA样品、promoter(10 μM)、探针L (10 μM)、探针R (10 μM)、T4 DNA连接酶、10
×
T4 DNA连接酶缓冲液和水混合，在37℃下孵育30 min，进行杂交和连接。加入T7 RNA聚合酶、10
×
T7 RNA聚合酶缓冲液、rNTPs和水进行转录扩增。加入DFHBI
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1T溶液(10 mM)，在37℃下反应12 h，而后使用Synergy H1 (BioTek, USA)酶标仪进行荧光光谱分析。激发波长为468 nm，发射波长为498 nm。
[0007]本专利技术所述的基于转录放大和点亮核酸适配体的单核酸变异(SNV)点亮策略的致病菌RNA突变成像方法原理如图1所示。探针L和探针R是一对分裂探针，用于识别SNVs，并作为转录模板。探针L由识别模块和启动子位点组成，探针R由识别模块和发光标签组成，探针L和探针R与细胞RNA互补。探针和细胞RNA杂交的缺口位点为所要检测的SNV，且连接酶对缺口位点的不匹配高度敏感。因此，可以通过连接反应来识别细胞RNA中的SNV。连接反应生成了一个可以转录的模板，而后生成了大量Broccoli RNA，其可与染料DFHBI
‑
1T结合而产生荧光，并点亮细胞内的SNV。首先，在沙门氏菌gyrA喹诺酮耐药决定区(QRDR)选择第83位(Ser83Phe)突变作为靶标SNV，用电泳分析验证了杂交和转录过程，并用细胞成像验证了其与染料的结合效果，结果如图2所示。所设计的探针与细胞RNA之间杂交的稳定性将影响连接效率和SNV辨别。结果表明，识别SNV的最佳识别模块长度为15 nt。使用RNA标记的点亮策略可以消除洗涤过程，同时与FISH方法相比显著提高信号增益,信号增益增强了2倍，如图3所示。本专利技术为评估此方法是否可以实现耐药菌的精确定量，获得种群的异质性信息，将耐药沙门氏菌与敏感沙门氏菌多种比例混合，荧光强度，并测定多种沙门氏菌的荧光强度以验证其对耐药沙门氏菌的检测是否准确。结果表明，该方法可以精确定量SNVs相关菌群的异质性，多种耐药沙门氏菌的平均荧光强度均显著高于其他类别沙门氏菌的荧光强度，如图4所示。
[0008]本专利技术为评估该方法在肠道切片中可视化具有SNV基因型的沙门氏菌的潜力，采用点亮策略的成像方法研究了沙门氏菌在盲肠的定植。而后基于成像方法，用具有抑制沙门氏菌肠道定植的潜力的低聚木糖和丙酸盐，评估了潜在的益生元对沙门氏菌盲肠定殖的影响。与对照组相比，添加低聚木糖或丙酸后，沙门氏菌定殖能力明显被抑制，低聚木糖和丙酸添加组对沙门氏菌定植的抑制作用分别是低聚木糖和丙酸单独添加组的1.8倍和2.2倍，低聚木糖与丙酸的协同作用可以提高沙门氏菌在肠道定植的抑制能力。为了进一步研究抑菌机制，本专利技术利用RT
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qPCR检测了参与定殖的沙门氏菌基因的表达水平。饲喂低聚木糖或丙酸时，加入影响定殖过程的序列的实本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于转录放大和单核酸变异(SNV)点亮策略的针对单细胞单碱基突变耐药致病菌和胃肠道耐药致病菌RNA突变成像方法，其特征在于该方法包括突变位点识别和信号转化输出两个过程，通过连接酶辅助转录反应实现对SNV的识别，使用点亮的RNA适配体作为报告探针，产生特异性荧光，点亮目标基因，消除了非特异性探针结合和清洗过程。2.根据权利要求1所述，其特征在于通过T4 DNA连接酶将两段引物连接，从而形成可供转录的、可进行信号转化的序列，并对引物目标基因的杂交长度进行了优化，所用的引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。3.根据权利1所述，其特征在于通过T7 RNA聚合酶进行该序列的转录扩增，得到的RNA核酸适配体与特异型染料DFHBI
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1T结合实现信号的转化，首先向杂交后的产物中加入T4 DNA连接酶与10

【专利技术属性】
技术研发人员：邓锐杰，史雅辰，夏许寒，何强，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：