一种基于竞争杂交的比率单细胞计数策略用于miRNA检测的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于竞争杂交的比率单细胞计数策略用于miRNA检测的方法，包括以下步骤：(1)制备核酸链AS

【技术实现步骤摘要】
一种基于竞争杂交的比率单细胞计数策略用于miRNA检测的方法


[0001]本专利技术属于生物检测领域，具体是一种基于竞争杂交的比率单细胞计数策略用于miRNA检测的方法。

技术介绍

[0002]微小核糖核酸（miRNAs）是一组短的(约22个核苷酸)内源性表达的非编码RNA，在生物和细胞过程中起着至关重要的作用。miRNA表达异常与癌症、糖尿病、心血管疾病和神经系统疾病等多种疾病直接相关。因此，开发高灵敏度的miRNA检测策略在生物学和医学上具有重要意义。近几十年来，许多分析策略，包括电化学，荧光，比色法，表面等离子体共振和电化学发光等miRNA检测的平台已被报道。但是，由于miRNA在癌细胞或组织中含量极低，当前迫切需要开发一种能够灵敏、快捷、简便、低成本、高选择性的检测平台。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的是针对现有技术的不足，而提供一种基于竞争杂交的比率单细胞计数策略用于miRNA检测的方法，该方法检测成本低、操作简单、灵敏度高、低背景。
[0004]实现本专利技术目的的技术方案是：一种基于竞争杂交的比率单细胞计数策略用于miRNA检测的方法，包括以下步骤：(1) 制备核酸链AS
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Sgc8，TD05和9组不同浓度的EH1；(2) 将步骤(1)所得的AS
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Sgc8和TD05分别与链霉亲和素修饰的Fe3O4纳米粒子孵育，通过磁分离洗涤分别制得Fe3O4@ AS
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Sgc8和Fe3O4@TD05探针，并将两种探针同浓度混合，制得混合探针1；(3) 将步骤(1)所得的9组不同浓度的EH1分别与步骤（2）所得的混合探针1孵育，9组不同浓度的EH1分别与AS
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Sgc8和TD05杂交，形成Fe3O4@AS
‑
EH1和Fe3O4@TD05
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EH1探针，混合后制得9组混合探针；(4) 将CCRF
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CEM和Ramos细胞分别用Dil和Hoechest 33342进行染色，并且同浓度混合，制得双色细胞；(5) 将步骤(3)所得的9组混合探针分别与步骤（4）所得的双色细胞孵育，磁分离洗涤后，检测Fe3O4纳米粒子捕获CCRF
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CEM细胞数目和Ramos细胞数目，计算出9组Ramos细胞数目与CCRF
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CEM细胞数目的比值；(6) 通过比较不同组Ramos细胞数目与CCRF
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CEM细胞数目的比值，区分不同EH1浓度的组，进而区分不同DNA
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21浓度。
[0005]所述步骤(1)中核酸链AS
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Sgc8，TD05和9组不同浓度的EH1通过以下方式得到：1)将AS，Sgc8，TD05，DNA
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21和H1核酸链分别用PBS稀释，然后分别对TD05，DNA
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21和H1核酸链进行退火，制得单链TD05，DNA
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21和H1；相同浓度的AS核酸链和Sgc8适配体链混合通过退火制得AS
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Sgc8杂交核酸链；
2)将9组不同浓度的DNA
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21分别和过量的H1混合孵育形成互补双链，每组中分别加入同浓度核酸外切酶III即Exo III对双链的3'顿端进行剪切，孵育相同时间后，使Exo III失活，制得9组EH1,每组形成的EH1浓度不同并与DNA
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21浓度成正比。
[0006]所述步骤(1)中核酸链AS
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Sgc8，TD05和9组不同浓度的EH1的制备过程为：i) 分别将AS，Sgc8，TD05，DNA
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21和H1核酸链用PBS稀释，分别将TD05，DNA
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21和H1核酸链置入90～100℃水浴锅中，4～6min后关闭水浴锅，等水浴锅温度降至常温取出，制得TD05，DNA
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21和H1核酸链；然后分别将45～55
µ
L AS核酸链和45～55
µ
L Sgc8的适配体链混合一起摇匀，置入90～100℃水浴锅中，4～6min后关闭水浴锅，等水浴锅温度降至常温取出，制得AS
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Sgc8杂交核酸链；ii) 将9组不同浓度的DNA
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21分别和过量的H1混合，35～40℃孵育35～45min，然后每组分别加入同浓度Exo III，分别35～40℃孵育35～45 min，最后65～75℃水浴15～25min使Exo III失活，制得9组EH1,每组形成的EH1浓度不同并与DNA
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21浓度成正比。
[0007]所述步骤（2）中Fe3O4纳米粒子的浓度为10 mg/mL。
[0008]所述步骤（2）中Fe3O4纳米粒子的直径为180～200 nm。
[0009]所述步骤（4）中Ramos细胞和CCRF
‑
CEM细胞的浓度均为5
×
105/mL。
[0010]所述步骤i)中TD05和AS
‑
Sgc8的浓度为10
ꢀµ
M，H1的浓度为20
µ
M。
[0011]所述步骤ii)中Exo III的浓度为0.1U/
µ
L。
[0012]所述步骤ii)中9组不同浓度的DNA
‑
21的浓度分别为100 nM、80 nM、60 nM、40 nM、20 nM、10 nM、2 nM、0.2 nM、0 nM。
[0013]所述步骤(6)中通过比较Ramos细胞数目与CCRF
‑
CEM细胞数目的比值，以区分不同DNA
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21浓度，具体为：若Ramos细胞数目与CCRF
‑
CEM细胞数目的比值较高，则该组存在DNA
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21，且Ramos细胞数目与CCRF
‑
CEM细胞数目的比值与DNA
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21的浓度成正比；若Ramos细胞数目与CCRF
‑
CEM细胞数目的比值较低，则该组DNA
‑
21浓度较低或不存在。
[0014]miRNA在细胞或组织中丰富度极低，要实现对miRNA的超灵敏检测，必须要设计合理的信号放大系统。本技术方案首先设计了一个基于Exo III的信号放大通路，用于检测低丰富度的miRNA；其次提出一种单细胞传感器，可以通过细胞信号去检测靶标，细胞有微米级的大小，易于染色，还可以很简便的通过荧光显微镜去观测输出信号；然后提出一种比率单细胞计数策略，结合磁分离技术通过比率数值去检测miRNA21浓度。
[0015]本技术方案的原理：本技术方案将H1与miRNA21杂交，通过Exo III对3'钝端的切割，将H1切割成单链EH1，解离的miRNA21与其他H1继续杂交，这样设计了一个将miRNA21转换成EH1的循环通路；然后用Ram本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于竞争杂交的比率单细胞计数策略用于miRNA检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1) 制备核酸链AS
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Sgc8，TD05和9组不同浓度的EH1；(2) 将步骤(1)所得的AS
‑
Sgc8和TD05分别与链霉亲和素修饰的Fe3O4纳米粒子孵育，通过磁分离洗涤分别制得Fe3O4@ AS
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Sgc8和Fe3O4@TD05探针，并将两种探针同浓度混合，制得混合探针1；(3) 将步骤(1)所得的9组不同浓度的EH1分别与步骤（2）所得的混合探针1孵育，9组不同浓度的EH1分别与AS
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Sgc8和TD05杂交，形成Fe3O4@AS
‑
EH1和Fe3O4@TD05
‑
EH1探针，制得9组混合探针；(4) 将CCRF
‑
CEM和Ramos细胞分别用Dil和Hoechest 33342进行染色，并且同浓度混合，制得双色细胞；(5) 将步骤(3)所得的9组混合探针分别与步骤（4）所得的双色细胞孵育，磁分离洗涤后，检测Fe3O4纳米粒子捕获CCRF
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CEM细胞数目和Ramos细胞数目，计算出9组Ramos细胞数目与CCRF
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CEM细胞数目的比值；(6) 通过比较不同组Ramos细胞数目与CCRF
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CEM细胞数目的比值，区分不同EH1浓度的组，进而区分不同DNA
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21浓度。2.根据权利要求1所述的一种基于竞争杂交的比率单细胞计数策略用于miRNA检测的方法，其特征在于，所述步骤(1)中核酸链AS
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Sgc8，TD05和9组不同浓度的EH1通过以下方式得到：1)将AS，Sgc8，TD05，DNA
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21和H1核酸链分别用PBS稀释，然后分别对TD05，DNA
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21和H1核酸链进行退火，制得单链TD05，DNA
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21和H1；相同浓度的AS核酸链和Sgc8适配体链混合通过退火制得AS
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Sgc8杂交核酸链；2)将9组不同浓度的DNA
‑
21分别和过量的H1混合孵育形成互补双链，每组中分别加入同浓度核酸外切酶III即Exo III对双链的3'顿端进行剪切，孵育相同时间后，使Exo III失活，制得9组EH1,每组形成的EH1浓度不同并与DNA
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21浓度成正比。3.根据权利要求1所述的一种基于竞争杂交的比率单细胞计数策略用于miRNA检测的方法，其特征在于，所述步骤(1)中核酸链AS
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Sgc8，TD05和9组不同浓度的EH1的制备过程为：i) 分别将AS，Sgc8，TD05，DNA
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21和H1核酸链用PBS稀释，分别将TD05，DNA
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21和H1核酸链置入90～100℃水浴锅中，4～6min后关闭水浴锅，等水浴锅温度降至常温...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡盛强，张胜锴，胡蓝双，唐晓岚，姚力嘉，
申请(专利权)人：广西师范大学，
类型：发明
国别省市：