一种基于双DNA步行器的高效动态DNA纳米系统及制备和应用技术方案

本发明专利技术属于电化学传感分析检测技术领域，具体涉及一种基于双DNA步行器的高效动态DNA纳米系统及制备和应用。本发明专利技术将磁性纳米颗粒(Magnetic Nanoparticles,MNPs)作为载体制备了多足型DNA步行器，步行链的发夹结构使其处于封闭状态，为了更大程度上对其进行激活，在同一颗粒表面同时修饰了封闭后的拴系型步行链，制备了一种新型的双DNA步行器，进一步制备了一种基于双DNA步行器的高效动态DNA纳米系统。本发明专利技术的高效动态DNA纳米系统对KRAS有着极高的灵敏度，除此之外，还表现出良好的特异性、重现性和稳定性，在对血清中的目标物进行分析时也测得了理想的回收率。分析时也测得了理想的回收率。分析时也测得了理想的回收率。

【技术实现步骤摘要】
一种基于双DNA步行器的高效动态DNA纳米系统及制备和应用


[0001]本专利技术属于电化学传感分析检测
，具体涉及一种基于双DNA步行器的高效动态DNA纳米系统及制备和应用。

技术介绍

[0002]公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
[0003]为了满足临床诊断对疾病标志物检测准确度的高要求，DNA步行器作为一种可编程、自主且高效的DNA纳米技术，在生物传感领域得到了越来越广泛的应用。从近些年的发展中可以发现，多足型DNA步行器因其较高的局部步行链浓度而能够在行走过程中与轨道连接更稳定，弥补了单足型和双足型DNA步行器在反应中容易脱轨的不足，因此表现出更优异的检测性能。在实际应用中，多数情况下需要先对多足型DNA步行器进行封闭处理以实现对目标物的响应，与此同时步行链也得到释放从而能够进行后续的反应。因为目标物往往含量极低且容易失活，所以在前期的工作中专利技术人利用目标物循环反应来提高对多足型DNA步行器的激活程度，专利技术人注意到目标物在多足型DNA步行器表面对其进行激活时，因容易脱离金纳米颗粒表面而导致反应效率不够理想，难以将高局部浓度的封闭步行链充分释放，这就会极大降低多足型DNA步行器后续的反应效率，无法发挥其出色的信号放大能力。因此为了进一步增强目标物循环在多足型DNA步行器激活过程中发挥的效果，开发出能够提高相关反应连续性的技术十分必要。
[0004]在DNA步行器的运行中，它们在轨道上的运动主要取决于不可控的随机碰撞，所以步行链除了浓度之外，其相对于轨道的位置也是决定反应效率的关键因素。Yang等人报道了一种定向的DNA步行器，在一个金纳米颗粒的表面具有空间受限的步行链和轨道链，步行链通过摆臂拴系在金纳米颗粒表面，能够限制DNA步行器在由DNA功能化的金纳米颗粒构建的三维轨道上的运动，实现了步行链和轨道链之间的空间受限定向碰撞，降低脱轨风险，加速酶促切割从而显著提高了反应效率。据专利技术人所知，目前还很少有通过拴系型步行链对多足型DNA步行器进行激活的相关报道，所以在这方面的研究十分值得尝试。
[0005]核酸酶辅助的目标物循环放大反应基于适配体识别和沃森
‑
克里克碱基互补配对原则，可以产生各种具有特定结构的DNA双链，以触发不同核酸酶如核酸内切酶和核酸外切酶的催化裂解反应，这将导致目标物或某些目标物识别相关核酸的再循环，从而显著提高灵敏度。其中，外切酶Ⅲ的工作原理是从3
’
平末端或凹末端逐步和定向地切下单核苷酸而不需要特定的识别位点，这使得核酸探针的设计更加灵活，而且外切酶Ⅲ还具有成本低、不易失活等优点，因此它被广泛应用于各种酶辅助目标物循环反应中。除了用于信号放大的重复核酸酶催化反应之外，外切酶Ⅲ还是最常用的DNA步行器的驱动力之一，外切酶Ⅲ驱动的自主DNA行走可以有效地简化生物测定操作并很好地保证生物传感器的可重复性，此外，由于其优异的水解速率，外切酶Ⅲ驱动的DNA步行器表现出很高的加工性和可移动性。因此
外切酶Ⅲ辅助的目标物循环放大反应可作为十分适当的放大技术与多足型DNA步行器相结合。

技术实现思路

[0006]为了解决现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一种双DNA步行器及其制备方法和在传感器中的应用。本专利技术将磁性纳米颗粒(Magnetic Nanoparticles,MNPs)作为载体制备了多足型双DNA步行器，步行链的发夹结构使其处于封闭状态，为了更大程度上对其进行激活，在同一颗粒表面同时修饰了封闭后的拴系型步行链，制备了一种新型的双DNA步行器，进一步制备了一种基于双DNA步行器的高效动态DNA纳米系统。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术是通过如下的技术方案来实现：
[0008]本专利技术的第一方面，提供了一种双DNA步行器的制备方法，包括以下步骤：
[0009]S1、将含有发夹H的Tris
‑
HCl缓冲液与含有拴系型步行链TW和封闭链B的Tris
‑
HCl缓冲液1：1混匀，加热并维持，随后降至室温维持，得到混合液待用；
[0010]S2、将步骤S1中得到的混合液用Tris
‑
HCl缓冲液混匀稀释，分散活化的MNPs，震荡过夜，用Tris
‑
HCl缓冲液洗涤以除去溶液中未结合的DNA，得到双DNA步行器；
[0011]所述发夹H的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述拴系型步行链TW的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述封闭链B的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
[0012]本专利技术的第二方面，提供了一种双DNA步行器，通过上述双DNA步行器的制备方法制备得到。
[0013]本专利技术的第三方面，提供了一种高效动态DNA纳米系统，包括上述双DNA步行器、传感平台、ExoⅢ、目标物和DNA
‑
MB；所述DNA
‑
MB的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
[0014]本专利技术的第四方面，提供了上述双DNA步行器和/或上述高效动态DNA纳米系统在制备核酸检测试剂盒中的应用。
[0015]上述本专利技术的一种或多种技术方案取得的有益效果如下：
[0016](1)本专利技术的双DNA步行器可通过磁分离的方式进行分离，使其在制备过程中更加的方便快捷且拥有更好的分离效果，通过巧妙的链设计，检测过程中也无需对多足型双DNA步行器进行清洗，能够极大简化检测时的操作；
[0017](2)以鼠类肉瘤病毒癌基因(KRAS)作为目标物，在外切酶Ⅲ的驱动下，通过目标物循环和拴系型步行链的三维行走实现了对双DNA步行器的充分激活，进而通过级联双DNA步行器在电极表面的快速滚动和比率型电化学生物传感器的双向信号放大实现对目标物的超灵敏电化学比率检测，所设计的高效动态DNA纳米系统对KRAS有着极高的灵敏度，展现出极大的实际应用潜力；
[0018](3)采用PAGE、TEM、UV
‑
Vis、Zeta电位等手段充分证实了双DNA步行器的成功制备以及方案的可行性；通过电化学测试对传感器的分析性能进行了综合的评估，线性范围为10aM
‑
1pM，检测限低至3.88aM，结果表明本专利技术的高效动态DNA纳米系统具有较高的灵敏度，除此之外，还表现出良好的特异性、重现性和稳定性，在对血清中的目标物进行分析时也测得了理想的回收率。
附图说明
[0019]构成本专利技术的一部分的说明书附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。
[0020]图1为本专利技术双DNA步行器及高效动态DNA纳米系统用于KRAS的超灵敏比率检测原理图；
[0021]图2为实施例1中MNPs(A)和MNP@(H+TW/B)(B)的TEM图；
[0022]图3为H和TW/本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种双DNA步行器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、将含有发夹H的Tris
‑
HCl缓冲液与含有拴系型步行链TW和封闭链B的Tris
‑
HCl缓冲液1：1混匀，加热并维持，随后降至室温维持，得到混合液待用；S2、将步骤S1中得到的混合液用Tris
‑
HCl缓冲液混匀稀释，分散活化的MNPs，震荡过夜，用Tris
‑
HCl缓冲液洗涤以除去溶液中未结合的DNA，得到双DNA步行器；所述发夹H的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述拴系型步行链TW的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述封闭链B的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。2.如权利要求1所述的双DNA步行器的制备方法，其特征在于，所述活化的MNPs的活化过程包括以下步骤：用MEST缓冲液将MNPs稀释至1mg/mL并充分清洗，磁分离后去除上清液；随后用含有15
‑
25mg/mLNHS和15
‑
25mg/mLEDC的0.1MMES缓冲液分散MNPs，25℃下震荡激活，先后用MES缓冲液和Tris
‑
HCl缓冲液各清洗MNPs两次，磁分离后去除上清液，得到活化的MNPs。3.如权利要求1所述的双DNA步行器的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述含有发夹H的Tris
‑
HCl缓冲液中发夹H的浓度为10
‑
30μM；所述含有拴系型步行链TW和封闭链B的Tris
‑
HCl缓冲液中拴系型步行链TW的浓度与所述含有发夹H的Tris
‑
HCl缓冲液中发夹H的浓度的壁纸的比值为1:10
‑
1:30；所述含有拴系型步行链TW和封闭链B的Tris
‑
HCl缓冲液中封闭链B的浓度为2
‑
5μM。4.如权利要求1所述的双DNA步行器的制备方...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱烨，李涛，赵冬梅，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：