一种检测尿嘧啶-DNA糖基化酶的熵驱动哑铃型DNAzyme组装回路系统及应用技术方案

本发明专利技术提供一种检测尿嘧啶

【技术实现步骤摘要】
一种检测尿嘧啶
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DNA糖基化酶的熵驱动哑铃型DNAzyme组装回路系统及应用


[0001]本专利技术属于酶检测
，具体涉及一种检测尿嘧啶
‑
DNA糖基化酶的熵驱动哑铃型DNAzyme组装回路系统及应用。

技术介绍

[0002]本专利技术
技术介绍
中公开的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
[0003]灵敏和准确监测活细胞内源性尿嘧啶
‑
DNA糖基化酶(UDG)对了解DNA修复途径和发现抗癌药物至关重要。传统的UDG活性测定方法包括凝胶电泳法、放射自显影和质谱(MS)，这些方法存在着放射性污染、仪器昂贵和灵敏度差的问题。此外，一些蛋白酶介导的等温信号扩增策略，如指数扩增反应(EXPAR)、滚环扩增(RCA)、外切酶介导的信号扩增、CRISPR/Cas12a催化的信号扩增等方法也用于UDG活性的检测，但是这些酶促反应往往受到狭窄的pH范围和离子浓度的限制，而且蛋白质酶容易受到周围微环境的影响而发生变化，这限制了它们在细胞裂解物或死细胞中的应用。此外，考虑到UDG在单个细胞间表达水平的变异性，这些系综平均UDG分析方法很容易忽略UDG的细胞异质性和空间信息。应该注意的是裂解物或固定细胞中的生物分子的物理化学性质(例如，含量和活性)与活细胞中的生物分子不完全相同。最近，等温无酶信号放大由于反应条件简单、温和，更适合于细胞内原位成像。因此，开发一种内源性无酶扩增策略用于直接观察活细胞中UDG活性是非常可取的。
[0004]由于其纳米级的可预见性、良好的可控性和生物相容性以及多用途的修饰能力，各种DNA人工回路在构建具有识别和可编程功能的生物传感系统方面显示出极大的潜力。目前已经开发了多种DNA人工回路用于RNA和酶的原位可视化，包括：DNAzyme、熵驱动DNA催化(EDC)、杂交链式反应(HCR)和催化发夹组装(CHA)。但是，它们的检测灵敏度受到线性信号(1:n)的限制。为了获得更高的信号，已经成功地设计了一些不同DNA回路集成的级联DNA回路，如级联CHA
‑
HCR回路、级联HCR回路、级联CHA
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DNAzyme回路和DNA树枝状大分子自组装等。尽管提高了灵敏度，但这些级联DNA放大器受到发夹底物和中间体在流体环境中缓慢动力学的限制，或由于树枝状DNA结构的空间位阻效应而逐渐缓慢的反应速率的限制。此外，这些级联DNA放大器需要小心设计发夹探针，而由于亚稳态发夹结构之间可能发生不希望有的相互作用而导致高背景信号。

技术实现思路

[0005]针对现有技术中的不足，本专利技术提供一种检测尿嘧啶
‑
DNA糖基化酶的熵驱动哑铃型DNAzyme组装回路系统及应用。本专利技术将熵驱动DNA催化(EDC)与DNAzyme生物催化剂相结合，构建了一个熵驱动的哑铃型DNAzyme组装回路系统。该系统能够产生更高的扩增信号，而且具有优异的体内外分析性能，且在实际检测过程中，可在室温下进行一步反应，不需要
严格的温度控制和复杂的反应程序。由于级联回路的高信号增强，该策略能够灵敏检测UDG活性，检测限达到为8.71
×
10
‑6单位每毫升，并能在单细胞水平上准确定量细胞内UDG活性。它可以进一步筛选UDG抑制剂，测量动力学参数，区分癌细胞和正常细胞，因此具有良好的实际应用之价值。
[0006]为实现上述技术目的，本专利技术的技术方案如下：
[0007]本专利技术的第一个方面，提供一种检测尿嘧啶
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DNA糖基化酶的熵驱动哑铃型DNAzyme组装回路系统，所述熵驱动哑铃型DNAzyme组装回路系统，所述系统至少包括双链检测底物，三链底物复合物，以及燃料探针和报告探针；
[0008]其中，所述双链检测底物由检测探针和触发探针互补构成，所述检测探针其核苷酸序列中修饰有尿嘧啶；当检测体系中存在UDG时，其识别尿嘧啶碱基，并通过水解尿嘧啶碱基和DNA磷酸骨架之间的N
‑
糖苷键将其从双链检测底物中分离出来，从而产生一个脱嘌呤/脱嘧啶(AP)位点；随后，检测体系中的APE1切割检测底物中的AP位点，释放触发探针。
[0009]所述三链底物复合物由连接探针、辅助探针1以及辅助探针2构成；
[0010]所述连接探针和燃料探针均包含结构域b和结构域g，结构域b和g为具有催化活性的DNAzyme单元；
[0011]所述报告探针至少包含一个腺苷核糖核苷酸(rA)，且报告探针两侧标记有荧光基团和猝灭基团；
[0012]释放的自由的触发探针与上述连接探针的趾端区域b结合，并通过趾端驱动链置换将辅助探针1从连接探针上置换下来，形成一个新的三链中间体(连接探针/触发探针/辅助探针2)，同时暴露连接探针的立足点区域d；然后，燃料探针与连接探针上新暴露的立足点区域d结合启动新的立足点辅助的分支迁移反应，导致辅助探针2和触发探针的释放以及连接探针和燃料探针的组装；释放的自由触发探针可以与新的连接探针结合，启动循环链置换反应，从而使连接探针/辅助探针1/辅助探针2复合物分解，产生丰富的连接探针/燃料探针双链；所述连接探针/燃料探针双链的两端包含结构域b和结构域g；
[0013]所述系统还包括辅助因子Mg
2+
，所述辅助因子Mg
2+
来源于MgCl2。加入辅助因子Mg
2+
后，激活DNAzyme的核糖核酸酶活性，从而催化报告探针在rA位置裂解为两个片段，导致荧光基团(如FAM)的荧光恢复和DNAzyme的释放；随后，释放的DNAzyme与新的报告探针杂交启动新一轮的裂解反应，导致大量报告探针水解并产生增强的荧光信号。
[0014]本专利技术的第二个方面，提供一种检测尿嘧啶
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DNA糖基化酶的试剂盒，所述试剂盒包含上述熵驱动哑铃型DNAzyme组装回路系统。
[0015]本专利技术的第三个方面，提供一种检测尿嘧啶DNA糖基化酶的方法，所述方法包括采用上述熵驱动哑铃型DNAzyme组装回路系统或试剂盒进行检测。
[0016]本专利技术的第四个方面，提供上述熵驱动哑铃型DNAzyme组装回路系统、试剂盒和/或方法在尿嘧啶
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DNA糖基化酶相关药物筛选和/或样品中尿嘧啶DNA糖基化酶检测分析中的应用。
[0017]上述一个或多个技术方案的有益技术效果：
[0018]1)上述技术方案所涉及的探针均为单链DNA结构，无需精心设计的发夹探针，大大简化了探针的设计。
[0019]2)上述技术方案中EDC扩增产物可以完全转化为具有催化活性的双DNAzyme单元，
消除了中间产物与DNA反应物随机扩散导致的二次信号扩增系统组装不完整的问题。
[0020]3)与单一EDC回路相比，双重EDC
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DNAzyme回路具有高信号和良好的体外检测本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测尿嘧啶
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DNA糖基化酶的熵驱动哑铃型DNAzyme组装回路系统，其特征在于，所述熵驱动哑铃型DNAzyme组装回路系统，所述系统至少包括双链检测底物，三链底物复合物，以及燃料探针和报告探针；其中，所述双链检测底物由检测探针和触发探针互补构成，所述检测探针其核苷酸序列中修饰有尿嘧啶；当检测体系中存在UDG时，其识别尿嘧啶碱基，并通过水解尿嘧啶碱基和DNA磷酸骨架之间的N
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糖苷键将其从双链检测底物中分离出来，从而产生一个脱嘌呤/脱嘧啶位点；随后，检测体系中的APE1切割检测底物中的AP位点，释放触发探针；所述三链底物复合物由连接探针、辅助探针1以及辅助探针2构成；所述连接探针和燃料探针均包含结构域b和结构域g，结构域b和g为具有催化活性的DNAzyme单元；所述报告探针至少包含一个腺苷核糖核苷酸，且报告探针两侧标记有荧光基团和猝灭基团。2.如权利要求1所述的检测尿嘧啶
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DNA糖基化酶的熵驱动哑铃型DNAzyme组装回路系统，其特征在于，释放的自由的触发探针与上述连接探针的趾端区域b结合，并通过趾端驱动链置换将辅助探针1从连接探针上置换下来，形成一个新的三链中间体，同时暴露连接探针的立足点区域d；然后，燃料探针与连接探针上新暴露的立足点区域d结合启动新的立足点辅助的分支迁移反应，导致辅助探针2和触发探针的释放以及连接探针和燃料探针的组装；释放的自由触发探针可以与新的连接探针结合，启动循环链置换反应，从而使连接探针/辅助探针1/辅助探针2复合物分解，产生丰富的连接探针/燃料探针双链；所述连接探针/燃料探针双链的两端包含结构域b和结构域g。3.如权利要求1所述的检测尿嘧啶
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DNA糖基化酶的熵驱动哑铃型DNAzyme组装回路系统，其特征在于，所述荧光基团为6
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羧基荧光素，所述猝灭基团为黑洞猝灭剂1。4.如权利要求1所述的检测尿嘧啶
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DNA糖基化酶的熵驱动哑铃型DNAzyme组装回路系统，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：李琛琛，吕福慧，罗细亮，
申请(专利权)人：青岛科技大学，
类型：发明
国别省市：