双级扩大DNA级联循环系统及其应用技术方案

本发明专利技术公开了一种双级扩大DNA级联循环系统及其应用，通过CAR+CHA+HCR构建一个精确成像系统。通过“CAR”组合链对目标物进行计算从而决定是否释放miR

【技术实现步骤摘要】
双级扩大DNA级联循环系统及其应用


[0001]本专利技术属于癌症检测
，尤其涉及一种双级扩增系统及其应用。

技术介绍

[0002]在世界各国，癌症已迅速成为死亡的主要原因，死亡率超过了中风和冠心病。根据《2020年癌症统计》，在全球范围内，2020年估计有1930万新病例和1000万癌症死亡病例。(2020年癌症统计数据)。(据估计，2020年全球将有1000万人死于癌症，1930万新确诊病例，癌症仍然是全球医疗保健的一个重大负担，但尚未得到解决。而通过准确的诊断和随后有效的治疗干预，癌症死亡率可以大大降低。准确识别癌细胞是癌症诊断的必要前提，可以促进及时治疗，大幅提高患者生存期。最近对癌症检测的研究集中在与癌细胞相关的生物标记的成像，可能是细胞表面蛋白质，细胞内基因内容或蛋白质。然而，确保癌症检测准确性的主要挑战包括癌细胞中生物标记物丰度低，以及这些生物标记物在癌细胞中的非特异性表达。由于生物标志物丰度低，一对一信号输出策略往往无法给出清晰的图像信号，导致假阴性结果和脱靶副作用。
[0003]自1993年在Caenorhabditis elegans中发现miRNA以来，已经在人类中发现了6个超过2000个miRNA，它们被认为作为后转录调控因子参与了超过30％的蛋白质编码基因的调控。在分子机制上，miRNAs通过减弱基因表达，诱导核糖核酸(RNA)切割和翻译抑制，主要通过RNA干扰(RNAi)途径将碱基配对到目标mrna的3'
‑
非翻译区(UTR)，从而抑制编码蛋白的合成。miRNAs参与调控早期发育、细胞分化、增殖、凋亡、发育时间、造血等生物学过程的多种通路，其表达模式受时间和空间的调控，miRNAs的异常表达与人类的各种疾病密切相关，如脂质代谢紊乱和癌症的发生、发展、转移以及治疗的耐药性。因此，miRNAs被认为是具有临床价值的潜在诊断和预后生物学标记和有前途的药物和基因治疗靶点。敏感、选择性检测microRNA表达水平对癌症的早期诊断、分期和监测具有重要意义。特别是，具有高空间分辨率的亚细胞位置和特定miRNAs分布的原位可视化对于理解miRNAs的生物学功能、药物靶点的发现和个性化治疗具有重要价值。然而，由于miRNAs具有体积小、家族成员序列同源性、在总RNA样本中丰度低等特点，对癌症相关miRNAs的准确分析仍具有挑战性。看起来，由于细胞内极其复杂，活细胞内miRNA的真正高效的原位成像至今仍未被探索。
[0004]通过基于DNA级联电路的等温扩增，如催化发夹组装(CHA)、熵驱动催化(EDC)和杂交链式反应(HCR)，提高癌症细胞中低丰度生物标记物原位荧光成像的灵敏度，已经投入了大量的努力。这些扩增方法进行一对多的信号输出，允许单个目标分子通过程序化DNA组装或DNA链生长聚合反应激活多个信号分子，仅使用几个人工可编程DNA序列就为无酶信号扩增铺平了道路。
[0005]克隆、微阵列和定量逆转录实时聚合酶链反应(qRT
‑
PCR)被广泛用于miRNA的鉴定和定量。然而，这些方法通常存在灵敏度有限、交叉杂交、容易出错的扩增，以及由于设计短miRNA引物的困难而缺乏有效的内部控制。此外，它们不适合在温和的生理条件下进行生物传感应用，尤其是细胞内成像。其他技术，如比色法、荧光、化学发光、表面增强拉曼光谱、电
化学测量和质谱等也经常被开发，基于纳米粒子的分析和深度测序也被用于miRNA的检测。
[0006]2021年，王珂敏课题组构建了一个手拉手分子探针，用于TK1 mRNA的可视化以及同时杀死癌细胞。通过结合化疗和基因沉默，在细胞表面实现了手牵手DNA瓦组装，以提高癌细胞的治疗效果。首先设计了4条DNA单链来构建一个tile motif(pH
‑
Apt
‑
TM)，该motif富含GC碱基，为阿霉素(Dox)插入提供位点。在pH
‑
Apt
‑
TM上设计了一个自猝灭分子信标(MB)，包含对TK1 mRNA的17个碱基识别序列和靶向MCF
‑
7细胞的适配体。PH诱导的聚合是由两个分裂的i
‑
motif DNA形成一个完整的分子间i
‑
motif。在中性pH下，pH
‑
Apt
‑
TM以单体形式存在，表现出普遍的细胞识别和内化。然而，一旦遇到靶细胞，细胞可以通过靶蛋白与适体的相互作用在细胞表面聚集pH
‑
Apt
‑
TM，同时，由于细胞外酸性pH，两个分裂的i
‑
motif片段趋于形成完整的分子间i
‑
motif结构，使得pH
‑
Apt
‑
TM聚集，导致尺寸增大、亲和力提高、细胞膜通透性增强的。此外，形成的大分子被内化到细胞中。大分子生物探针上的MB通过形成稳定的双键与目标mRNA杂交，MB的打开导致荧光染料的恢复，从而显示出mRNA的特异性成像，同时伴随杂交导致的基因沉默。
[0007]尽管如此，现如今存在的癌症检测方法存在着许多问题：
[0008](1)目标物浓度低，信号难检测。
[0009](2)单一目标物易引发假阳性
[0010](3)在癌细胞中过表达的目标物，在正常细胞中也微表达。即检测的目标物没有绝对的不存在。
[0011]在此，我们开发了一个“计算
‑
释放”DNA逻辑(CAR)门控双扩增DNA级联循环，它能满足精确识别癌细胞的这一关键标准。该新系统由双扩增DNA级联电路(称为CHA
‑
HCR)、CAR逻辑门和MnO2纳米载体组成。CHA
‑
HCR电路作为一对多的信号放大元件，由CHA放大电路和HCR放大电路两个功能模块组成。“计算
‑
释放”(CAR)DNA逻辑门的设计是动态计算和比较两种生物标志物的相对浓度，然后决定是否释放靶miR
‑
21激活CHA
‑
HCR电路。MnO2纳米花用于传递CAR逻辑门和CHA
‑
HCR电路，促进与生物膜的融合，在细胞内谷胱甘肽(GSH)存在的情况下释放DNA探针，用于智能感知和癌症识别。

技术实现思路

[0012]有鉴于此，本专利技术旨在提出一种双级扩大DNA级联循环系统，用于肿瘤靶向检测癌细胞，以解决传统化学检测方法精准性差，效果差，信号低大的问题。
[0013]为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0014]一种双级扩大DNA级联循环系统，包括CHA
‑
HCR双扩增DNA级联电路和MnO2纳米载体，MnO2纳米载体用于负载递送CHA
‑
HCR双扩增DNA级联电路进入细胞，促进与生物膜的融合，在细胞内谷胱甘肽(GSH)存在的情况下释放CHA
‑
HCR探针，用于智能感知和癌症识别，
[0015]在miR本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种双级扩大DNA级联循环系统，其特征在于，包括CHA
‑
HCR电路和MnO2纳米载体，MnO2纳米载体用于负载递送CHA
‑
HCR电路进入细胞，促进与生物膜的融合，在细胞内谷胱甘肽存在的情况下释放CHA
‑
HCR探针，用于智能感知和癌症识别，在miR
‑
21的作用下触发CHA
‑
HCR双扩增DNA级联电路，实现多重荧光基团发光，所述CHA
‑
HCR电路作为一对多的信号放大元件，由CHA放大电路和HCR放大电路两个功能模块组成，CHA放大电路包括发夹链H1和H2，HCR放大电路包括发夹链H3和H4，具体序列如下：H
1 SEQ ID NO:1：5
’‑
CA GAC TG A TGT TGA T AC CGA TTC GCA A TCA ACA TCA GTC TG A TAA GCT A
‑3’
，H
2 SEQ ID NO:2：5
’‑
CGC TTC TAC ACT A CC GAT TCG CAA TCA CA GAC TGA TGT TGA T TGC GAA TCG GT AT CAA CAT
‑3’
，H
3 SEQ ID NO:3：5
’‑
TTG CGA ATC GGT AGT GTA GAA GCG CTC CAT CGC TTC TAC ACT TCC GAT
‑3’
，H
4 SEQ ID NO:4：5
’‑
CGCTTCTACACTTCCGATTCGCAATTTT TTT TTTTATCGGAAGTGTAGAAGCGATGGAG
‑3’
，其中，发夹链H3的3
’
端和5
’
分别标记有荧光基团和猝灭基团。2.根据权利要求1所述的双级扩大DNA级联循环系统，其特征在于，还包括CAR逻辑门，CAR逻辑门负载在MnO2纳米载体上，与CHA
‑
HCR构成CAR
‑
CHA
‑
HCR，CAR逻辑门用于分析miR
‑
21和miR
‑
892b的含量，当miR
‑
21高表达，miR
‑
892b低表达时，释放miR
‑
21，在miR
‑
21的作用下触发CHA
‑
HCR双扩增DNA级联电路，实现多重荧光基团发光，CAR逻辑门包括LOCK链、CL1链和CL2链，CL1链和CL2链分别与LOCK链部分碱基配对形成...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋志灵，晁齐齐，
申请(专利权)人：青岛科技大学，
类型：发明
国别省市：