用于捕获检测CTC的低检测限纳米马达及制法和应用制造技术

本发明专利技术提供了用于捕获检测CTC的低检测限纳米马达及制法和应用，纳米马达的制备方法包括如下步骤：(1)将杂合细胞膜包覆在纳米颗粒上，所述杂合细胞膜由癌细胞膜和白细胞膜组成，所述癌细胞膜和白细胞膜的膜蛋白重量比为2:1；(2)将脲酶固定在步骤(1)所得物的一侧；(3)将适配体和适配体的不完全互补链加入步骤(2)所得物进行反应，得到纳米马达。得到纳米马达。得到纳米马达。

【技术实现步骤摘要】
highly sensitive and selective aptamer cytosensorwith enzyme amplification,Chem Commun(Camb),52(2016)406
‑
409.
[0011][4]K.Xiao,J.Liu,H.Chen,S.Zhang,J.Kong,A label
‑
free and high
‑
efficient GO
‑
based aptasensor for cancer cells based on cyclic enzymatic signal amplification,Biosens Bioelectron,91(2017)76
‑
81.
[0012][5]T.Yu,P.P.Dai,J.J.Xu,H.Y.Chen,Highly Sensitive Colorimetric Cancer Cell Detection Based on Dual Signal Amplification,ACS Appl Mater Interfaces,8(2016)4434
‑
4441.

技术实现思路

[0013]针对现有技术的需求，本专利技术的目的在于提供一种针对CTC在血液中的含量仅为1cells mL
‑1这一情况，检测限低至1cells mL
‑1的、针对CTC的检测技术。
[0014]为了实现上述目的，本专利技术提供的技术方案如下：
[0015]一种具有低检测限用于捕获检测CTC的纳米马达的制备方法，所述方法包括如下步骤：
[0016](1)将杂合细胞膜包覆在纳米颗粒上，所述杂合细胞膜由癌细胞膜和白细胞膜组成，所述癌细胞膜和白细胞膜的膜蛋白重量比为2:1；
[0017](2)将脲酶固定在步骤(1)所得物的一侧；
[0018](3)将适配体和适配体的不完全互补链加入步骤(2)所得物进行反应，得到纳米马达；
[0019]所述纳米马达捕获循环肿瘤细胞后，用探针对循环肿瘤细胞进行检测；
[0020]所述适配体为：5
′‑
ACA GCA TCC CCA TGT GAA CAA TCG CAT TGT GAT TGT TAC GGT TTC CGC CTC ATG GAC GTG CTG
‑
cholesterol
‑3′
；
[0021]所述适配体的不完全互补链为：3
′‑
TGT CGT AGG GGT ACA TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT GAG TAC CTG CAC GAC
‑5′
；
[0022]所述探针的制备方法为：
[0023]将5端带炔基互补链和化合物Ⅰ分别加入水和二甲基亚砜中，将所得水溶液和二甲基亚砜溶液在相同溶质浓度下进行等体积混合，然后加入摩尔比为1:2的CuSO4和维生素C钠进行反应，即得到所述探针；
[0024]所述5端带炔基互补链为：5
′‑
alkynyl
‑
ACA GCATCC CCATGT AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA CTC ATG GAC GTG CTG
‑3′
；
[0025]所述化合物Ⅰ如式<1>所示；
[0026][0027]。
[0028][0029]本专利技术在研究的过程中发现，即使在专利技术人的前期研究成果CN114366811A中，由三种细胞膜组成的杂合膜在CN 114366811A中的捕获率更高；但在本专利技术中，当加入本专利技术的适配体后，选择由三种细胞膜组成的杂合膜制备本专利技术的纳米马达，其对CTC的捕获效率出现了大幅度的下降，可能的原因在于三种细胞膜组成的杂合膜在与适配体和不完全互补链结合时，出现了结合不均衡或不稳定的情况，导致自驱动运动稳定性下降。可喜的是，在本专利技术中，当仅采用癌细胞膜和白细胞膜组成杂合细胞膜后，对于CTC的捕获效率反而得到了提高，达到96.7％。可能的原因在于适配体和不完全互补链的加入，增加了纳米马达表面物质的结合稳定性。
[0030]与此同时，专利技术人同样发现，适配体的选择对于CTC的检测限而言，影响是较大的。如本专利技术的一个例子所示，当替换适配体后，所得检测限仅能达到100和125cells mL
‑1的水平，导致相应的技术方案难以用于CTC的实际检测应用。
[0031]作为本专利技术的一个可实施的技术方案，步骤(1)中，所述纳米颗粒包括Fe3O4磁性纳米颗粒。
[0032]作为本专利技术的一个可实施的技术方案，所述杂合细胞膜通过将不同细胞膜通过聚碳酸酯多孔膜进行挤压融合而得。
[0033]作为本专利技术的一个可实施的技术方案，在固定脲酶时，先将步骤(1)所得物均匀吸附在聚赖氨酸修饰的细胞培养板上，再向培养板中加入N
‑
羟基磺酸基琥珀生物素和链霉亲和素进行反应，然后加入生物素修饰的脲酶进行反应；所述生物素修饰的脲酶为将脲酶溶解于PBS缓冲液中并加入N
‑
羟基磺酸基琥珀生物素反应所得。
[0034]作为本专利技术的优选技术方案，适配体和适配体的不完全互补链的添加量相同；适配体和适配体的不完全互补链相对于步骤(2)所得物针对两者的结合力而言是过量。
[0035]作为本专利技术的优选技术方案，在制备所述探针时，反应完成后，通过二氯甲烷萃取去除未反应的化合物Ⅰ，再通过反向HPLC纯化。
[0036]作为本专利技术的优选技术方案，在制备所述探针时，反应时间为24h，反应温度为20
‑
30℃。
[0037]本专利技术的另外一个目的在于提供由上述制备方法制备得到的具有低检测限用于捕获检测CTC的纳米马达。
[0038]本专利技术还有一个目的在于提供上述纳米马达在用于捕获检测CTC方面的应用。具
体的，所述应用方法为：在样品中加入所述仿生纳米马达和尿素，利用纳米马达与循环肿瘤细胞结合，通过磁场分离捕获的循环肿瘤细胞，然后在剩余反应中加入探针并通过探针荧光强度与循环肿瘤细胞数量的对应关系建立标准检测方程，利用标准检测方程检测和定量循环肿瘤细胞浓度。
[0039]本专利技术的有益效果：
[0040]本专利技术所得纳米马达可用于CTC的捕获、检测，对于CTC的捕获效率可达96.7％，检测限低至1cells mL
‑1，具有良好的实际应用前景。
附图说明
[0041]图1为本专利技术纳米马达的制备流程示意图；
[0042]图2为本专利技术检测CTC的过程示意图；
[0043]图3为本专利技术探针的制备过程示意图；
[0044]图4为不同浓度尿素溶液中纳米马达的运动轨迹；
[0045]图5为不同浓度尿素溶液中纳米马达的均方位移；...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种具有低检测限用于捕获检测CTC的纳米马达的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)将杂合细胞膜包覆在纳米颗粒上，所述杂合细胞膜由癌细胞膜和白细胞膜组成，所述癌细胞膜和白细胞膜的膜蛋白重量比为2:1；(2)将脲酶固定在步骤(1)所得物的一侧；(3)将适配体和适配体的不完全互补链加入步骤(2)所得物进行反应，得到纳米马达；所述纳米马达捕获循环肿瘤细胞后，用探针对循环肿瘤细胞进行检测；所述适配体为：5
′‑
ACA GCA TCC CCA TGT GAA CAA TCG CAT TGT GAT TGT TAC GGT TTC CGC CTC ATG GAC GTG CTG
‑
cholesterol
‑3′
；所述适配体的不完全互补链为：3
′‑
TGT CGT AGG GGT ACA TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT GAG TAC CTG CAC GAC
‑5′
；所述探针的制备方法为：将5端带炔基互补链和化合物Ⅰ分别加入水和二甲基亚砜中，将所得水溶液和二甲基亚砜溶液在相同溶质浓度下进行等体积混合，然后加入摩尔比为1:2的CuSO4和维生素C钠进行反应，即得到所述探针；所述5端带炔基互补链为：5
′‑
alkynyl
‑
ACA GCA TCC CCA TGT AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA CTC ATG GAC GTG CTG
‑3′
；所述化合物Ⅰ如式<1>所示...

【专利技术属性】
技术研发人员：李静怡，赵龙，公立鑫，张甘，
申请(专利权)人：核工业四一六医院，
类型：发明
国别省市：