基于水凝胶微球的单细胞多组分核酸荧光定量分析方法技术

本发明专利技术公开了基于水凝胶微球的单细胞多组分核酸荧光定量分析方法，包括制备多种靶标核酸分子识别捕获探针；采用微流控芯片制备包裹单细胞且负载捕获探针的水凝胶微液滴；经紫外光照水凝胶微液滴固化成水凝胶微球，捕获探针被共价结合在水凝胶微球骨架上；细胞裂解，靶标核酸分子从细胞中释放，被捕获探针识别并原位引发催化发卡自组装反应，放大靶标核酸分子信号；经滚环扩增反应对靶标核酸分子信号二次放大；引入荧光标记的报告序列，对滚换扩增产物荧光标记；通过共聚焦断层扫描对水凝胶微球中的靶标核酸分子引起的荧光信号定量检测。本发明专利技术适用于共聚焦断层扫描荧光定量检测和流式细胞术检测，有望用于大量细胞单细胞多组分核酸荧光定量分析。分核酸荧光定量分析。

【技术实现步骤摘要】
基于水凝胶微球的单细胞多组分核酸荧光定量分析方法


[0001]本专利技术具体涉及一种基于水凝胶微球包裹封装单细胞进行原位裂解，利用水凝胶微球中负载的特异性检测探针对细胞裂解液中的目标核酸分子进行识别、捕获、信号放大检测的荧光定量分析方法，属于单细胞成分分析


技术介绍

[0002]单个细胞内多组分关键生物分子的准确定量分析，对于揭示细胞异质性，发现“罕见样本”，区分细胞亚型以及确定肿瘤细胞分型，甚至是癌症早期诊断都具有重要意义。
[0003]液滴微流控技术通过形成油包水的微液滴实现对单个目标细胞的分离与封装，避免了检测过程中目标细胞与外界环境接触对样品造成的污染，因此成为单细胞分析的有力工具。
[0004]Guo等人
[1]基于微流控平台与DNA自组装信号放大反应联用发展了一种高通量单细胞中单种miRNA荧光定量检测方法。单个细胞与细胞裂解液，靶标核酸分子的DNA检测探针共同封装在单分散的油包水微液滴中，细胞裂解后释放靶标miRNA，引起DNA检测探针的催化发卡自组装反应，产生荧光信号的恢复。利用实验室搭建的光路对单个微液滴内的荧光信号进行检测，该方法仅限于实验室内使用，且油包水的微液滴不适用于流式细胞术等高通量检测方法。同时，当液滴微流控方法应用于单细胞内多组分核酸分子的荧光分析时，多种目标待测物组分所对应的检测探针以及信号放大反应物需要同时被封装进单个微液滴内。这使得微液滴狭小空间内反应物非特异性碰撞概率提高，产生交叉反应并导致背景信号升高。与此同时，微液滴一旦形成，反应物或反应产物将难以加入或从微液滴中移除，进一步影响检测精度，不利于单细胞多组分核酸的检测应用。
[0005][1]S.Guo,W.N.Lin,Y.Hu,G.Sun,D.T.Phan,C.H.Chen,Lab Chip 2018,18,1914
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1920.

技术实现思路

[0006]本专利技术提供了一种基于水凝胶微球的单细胞多组分核酸荧光定量分析方法，其解决的技术问题如下：
[0007](1)传统的液滴微流控技术应用于单细胞内多组分核酸分子的荧光分析检测时，由于微液滴一旦形成，检测过程中所需要的探针等反应物难以加入其中，所以单细胞、细胞裂解液以及靶标分子的相关检测探针需要同时封装进油包水的微液滴中，且反应完成后，微液滴中未反应的探针无法通过离心等方法去除，在微液滴的狭小空间内产生交叉反应并导致背景信号升高。针对这一问题，本专利技术在传统液滴微流控技术中的水相通道引入PEG
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DA水凝胶前聚体溶液，并对靶标核酸分子识别捕获探针进行PEG
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acrylate化修饰。单个细胞与PEG
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acrylate化的捕获探针同时被封装进PEG
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DA水溶液的微液滴中，经过紫外光照，丙烯酸酯基团发生加成反应，PEG
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DA相互交联形成三维网络结构将细胞固定在其中，PEG
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acrylate化的捕获探针通过末端的丙烯酸酯基团与PEG
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DA的加成反应，被共价结合在水凝
胶微球的骨架上。与微液滴相比，水凝胶微球具有固体的机械强度，可以进行离心分离；其疏松多孔的网络结构方便反应物的自由扩散，将水凝胶微球从油相转移到水相后可在检测过程中加入或去除反应物，减少非特异性的交叉反应，降低背景信号，提高检测灵敏度。
[0008](2)将荧光数点方法与水凝胶微球联用进行单细胞内核酸分子荧光定量分析时，单个核酸分子经过核酸扩增产生一个荧光信号点，当核酸分子之间距离较近时，荧光信号点堆叠造成核酸分子计数的偏差。为解决这一问题，本专利技术设计了具有催化发卡自组装(CHA)信号放大功能的靶标核酸分子识别捕获探针，细胞裂解后靶标核酸分子从细胞内释放，被分布在水凝胶骨架上的捕获探针识别捕获，并进行循环放大，单个核酸分子在水凝胶微球上激活多个捕获探针用于引发进一步的滚换扩增(RCA)反应，使得荧光信号遍布整个水凝胶微球，可选择典型截面进行扫描，统计荧光值，与标准曲线配合即可计算单个细胞内的靶标核酸分子拷贝数。
[0009]本专利技术的原理如下：
[0010]本专利技术中设计了一种流动聚焦型微流控芯片用于制备包裹单细胞的水凝胶微球，实现了原位裂解并识别捕获单细胞中的目标核酸分子，用于后续信号放大检测。
[0011]针对多种待测靶标核酸分子设计了特异性的自组装捕获探针，探针末端修饰的DBCO基团与N3‑
PEG
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acrylate高分子一端的N3基团发生点击反应，得到PEG
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acrylate化的捕获探针，与PEG
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DA水凝胶前聚体溶液一同通入微流控芯片的水相通道中，经油相切割生成油包水的微液滴。水凝胶前聚体溶液微液滴在紫外光照下，丙烯酸酯基团之间发生加成反应，相互交联形成具有三维网络结构的水凝胶微球，捕获探针通过末端的丙烯酸酯基团与PEG
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DA加成，共价结合到水凝胶微球骨架上。
[0012]靶标核酸分子识别捕获探针由具有茎环结构的探针H1、H2与末端修饰DBCO官能团的DBCO
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DNAnanowire按1：1：1等物质的量混合后三条DNA链基于碱基互补配对反应自组装得到，该捕获探针具有CHA信号放大功能，细胞裂解后靶标核酸分子从细胞内释放，被分布在水凝胶骨架上的捕获探针识别捕获，并进行循环放大，单个核酸分子在水凝胶微球上激活多个捕获探针用于引发进一步的滚换扩增反应，使得荧光信号遍布整个水凝胶微球，可选择典型截面进行扫描，统计荧光值，与标准曲线配合即可计算单个细胞内的靶标核酸分子拷贝数。
[0013]联用等温酶扩增反应(滚换扩增反应，RCA)对miRNA信号进行二次放大，引入荧光标记的报告序列，对滚换扩增产物进行荧光标记。通过共聚焦断层扫描实现对水凝胶微球中目标miRNA引起的荧光信号的定量检测。
[0014]本专利技术的技术方案如下：
[0015]基于水凝胶微球的单细胞多组分核酸荧光定量分析方法，包括：
[0016]制备多种靶标核酸分子识别捕获探针；
[0017]采用微流控芯片制备包裹单细胞且负载所述捕获探针的水凝胶微液滴；经紫外光照水凝胶微液滴固化成水凝胶微球，所述捕获探针被共价结合在水凝胶微球的骨架上；
[0018]细胞裂解，靶标核酸分子从细胞中释放，被所述捕获探针识别并原位引发CHA反应，放大靶标核酸分子的信号；
[0019]经进一步的RCA反应对靶标核酸分子信号二次放大；引入荧光标记的报告序列，对上述RCA反应的产物荧光标记；通过共聚焦断层扫描实现对水凝胶微球中的靶标核酸分子
引起的荧光信号的定量检测。
[0020]进一步地，所述制备多种靶标核酸分子识别捕获探针：所述捕获探针与N3‑
PEG
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acrylate高分子，基于捕获探针末端修饰的DBCO与N3基团之间的点击反应共价连接，得到PEG
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于水凝胶微球的单细胞多组分核酸荧光定量分析方法，其特征在于，包括：制备多种靶标核酸分子识别捕获探针；采用微流控芯片制备包裹单细胞且负载所述捕获探针的水凝胶微液滴；经紫外光照水凝胶微液滴固化成水凝胶微球，所述捕获探针被共价结合在水凝胶微球的骨架上；细胞裂解，靶标核酸分子从细胞中释放，被所述捕获探针识别并原位引发催化发卡自组装反应，放大靶标核酸分子的信号；经进一步的滚环扩增反应对靶标核酸分子信号二次放大；引入荧光标记的报告序列，对上述滚换扩增反应的产物荧光标记；通过共聚焦断层扫描实现对水凝胶微球中的靶标核酸分子引起的荧光信号的定量检测。2.如权利要求1所述的基于水凝胶微球的单细胞多组分核酸荧光定量分析方法，其特征在于，所述制备多种靶标核酸分子识别捕获探针：所述捕获探针与N3‑
PEG
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acrylate高分子，基于捕获探针末端修饰的DBCO与N3基团之间的点击反应共价连接，得到PEG
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acrylate化的捕获探针。3.如权利要求2所述的基于水凝胶微球的单细胞多组分核酸荧光定量分析方法，其特征在于，采用流动聚焦型微流控芯片制备包裹单细胞且负载所述捕获探针的PEG
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DA水凝胶前聚体溶液微液滴；经紫外光照该PEG
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DA水凝胶前聚体溶液微液滴中的PEG
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DA分子之间发生自由基聚合反应，形成三维网络结构，微液滴固化成水凝胶微球，所述PEG
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acryl...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘颖，鞠熀先，王莹菲，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：