人类源性ACTIN基因核酸电化学探针及其制备方法和用途技术

本发明专利技术提供一种人类源性ACTIN基因核酸电化学探针及其制备方法和用途，所述探针包含依次串联的特异性结合区、连接区、以及电化学信号结合区，所述特异性结合区为核苷酸链，可与目标基因进行互补配对，所述电化学信号结合区为核苷酸链，其中电化学信号结合区尾端的核苷酸分子的磷酸根基团上连接一个二茂铁分子。当探针与目标基因结合以后，二茂铁产生特异性电信号，从而实现基因靶点的检测。从而实现基因靶点的检测。从而实现基因靶点的检测。

【技术实现步骤摘要】
人类源性ACTIN基因核酸电化学探针及其制备方法和用途


[0001]本专利技术涉及生物
，特别是涉及人类源性ACTIN基因核酸电化学探针及其制备方法和用途。

技术介绍

[0002]电化学DNA生物传感器是以DNA为敏感元件或检测对象，将核酸分子特异性识别过程通过换能器记录为电信号，从而实现对核酸的定性或定量检测的生物传感系统。电化学DNA生物传感器兼具核酸分子杂交技术、电化学方法特性，凭借成本低、操作简单、灵敏度高、受环境干扰少等优势受到市场关注。随着技术进步，电化学DNA生物传感器有望成为主流DNA测定技术。
[0003]DNA电化学探针是电化学DNA生物传感器的核心组成，根据电化学探针上修饰的基团不同，可采用直接电化学检测和间接电化学检测两种方法对电信号进行检测。目前市场上主流的是间接电化学传感器，即基于ELISA技术改进的电化学发光免疫测定(ECLI)，通过在DNA探针上连接可被电信号激活的荧光基团，将电信号转化为荧光信号并判断检测结果。直接电化学检测传感器是通过在DNA电化学探针上修饰电化学活性标记物，如过渡金属和无机半导体纳米粒子等，当被标记过的电化学探针捕获到目的DNA序列时，会在传感器电场中发生氧化还原反应，将产生的瞬时电信号并判断检测结果。尽管直接检测法比间接检测法更加方便且稳定可靠，但电化学活性标记物存在原料昂贵，修饰困难，回收率低等一系列问题，限制了直接检测电化学传感器的使用，因此需要开发新的电化学探针制备方法，以满足市场需求。
[0004]β
‑
Actin中文名叫做β
‑
肌动蛋白，是横纹肌肌纤维中的一种主要蛋白质成分，也是肌肉细丝及细胞骨架微丝的主要成分。由于其在人体细胞内表达水平稳定，被确认为一种“看家基因(house keeping gene)”，因而在很多基因检测实验中作为内参使用，以确定样本用量和排除实验本身的系统误差。但目前没有actin基因进行电化学检测的产品。

技术实现思路

[0005]鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种检测人类ACTIN基因的核酸电化学探针及其制备方法和用途，同时用于解决现有电化学探针合成技术中依赖昂贵仪器核酸电化学探针价格昂贵的问题。
[0006]本专利技术一方面提供了一种用于检测核酸的电化学探针，所述探针包含依次串联的特异性结合区、连接区、以及电化学信号结合区，所述特异性结合区为核苷酸链，可与目标基因进行互补配对，所述电化学信号结合区为核苷酸链，其中电化学信号结合区尾端的核苷酸分子的磷酸根基团上连接一个二茂铁分子。
[0007]所述电化学信号结合区不与特异性结合区存在4个以上的相同核苷酸序列，所述电化学信号结合区上的二茂铁中的铁原子可以在特定电场(电化学工作站)中发生氧化还原反应，由+3价铁原子变为+2价铁原子，产生电化学信号，而被检测到。电化学工作站为现
有已知技术，例如autolab电化学工作站。
[0008]一般地，目标基因长度较长，我们通常检测选取其保守位点作为检测对象，即作为特异性结合区的结合区域。
[0009]通常来说，特异性结合区的长度为15
‑
40个核苷酸；电化学信号结合区长度为5
‑
10个核苷酸；连接区可以是常用的连接片段可以是分子长链，例如可以是乙二醇分子链、乙二胺链，通常来说分子链内的分子数2
‑
20；连接区，即linker区，保证不同区域的功能独立执行，不发生串扰。
[0010]进一步地，所述特异性结合区用于检测人类源性ACTIN基因，探针核苷酸序列SEQ IDNO.2所示。
[0011]本专利技术的另一方面提供了上述核酸电化学探针的制备方法，所述方法包括以下步骤：
[0012]a)合成探针单链；
[0013]b)在探针中加入氨基二茂铁分子，使得电化学信号结合区加载二茂铁分子。
[0014]进一步地，所述方法还包括对电化学探针进行纯化。
[0015]进一步地，所述纯化的方法可以为乙醇提取法或者HPLC法。
[0016]本专利技术的另一方面提供了上述电化学探针用于检测核酸分子的用途。例如用于检测人类源性ACTIN基因。
[0017]本专利技术的另一方面提供了一种用于检测核酸的产品，所述产品包含上述电化学探针。产品中通常同时含还有常用的核酸扩增试剂，例如PCR试剂或LAMP扩增试剂。例如，LAMP扩增试剂至少包括MgSO4、缓冲液、dNTPs、KCl、(NH4)2SO4、Bst DNA polymerase、酚红、灭菌水中至少一种。
[0018]关于上述探针的使用方法，与目前已知的电化学探针使用方法类似，在此不再展开叙述。如上所述，本专利技术的核酸电化学探针，具有以下有益效果：
[0019](1)成本低廉：氨基二茂铁的价格低廉，远远低于进口碘代二茂铁的价格。不依赖仪器，不需要昂贵的DNA合成仪。小型实验室也可以自行制备。
[0020](2)操作简便：制备方法简单，多步前处理，一步法反应，操作简单回收率高。
[0021](3)其灵敏度与碘代二茂铁修饰的探针相当。
附图说明
[0022]图1电化学探针化学反应示意图；
[0023]图2方波伏安法对电化学探针的电化学功能验证；
[0024]图3自研DNA探针与委托合成探针的比较。
具体实施方式
[0025]二茂铁标记的DNA电化学探针，例如碘代二茂铁标记的探针，是目前已经被报道过的可用于检测核酸的电化学探针。目前制备二茂铁标记的DNA电化学探针常用的无机半导体纳米材料如纳米量子点ZnS,CdS等价格昂贵，原料每毫克上百元到上千元人民币不等。二茂铁标记的DNA电化学探针，目前主流的加工工艺有两种。第一种为使用二茂铁标记的单核苷酸为原料，在核酸合成仪上进行DNA固相合成。第二种方案采用碘代二茂铁为原料，需要
多步前处理在核酸合成仪上进行DNA固相合成。以上两种方法都需要使用材料和合成仪器都较为昂贵。
[0026]我们采用氨基二茂铁为原料，价格低廉(每毫克10元左右)，在保证了其灵敏度的同时，极大的降低了核酸电化学探针制备成本。同时，我们可以委托专业的核酸合成公司合成基因片段后(价格低廉)，我们自行进行二茂铁修饰。我们做了很多实验已经证实我们制备的电化学探针完全与目前报道较多的碘代二茂铁标记的探针检测结果相当。以下我们提供了以人类ACTIN基因作为具体的检测对象作为例子，对我们的探针进行验证，证实了我们制备的电化学探针其回收率能稳定达到80％以上，完全可以替代现有技术中的电化学探针(ACTIN基因作为管家基因，广泛在基因荧光定量实验中作为阴性对照，以排除样本特异性或实验操作对实验结果造成的误差)。
[0027]以下通过特定的具体实例说明本专利技术的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本专利技术的其他优点与功效。本专利技术还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测核酸的电化学探针，其特征在于，所述探针包含依次串联的特异性结合区、连接区、以及电化学信号结合区，所述特异性结合区为核苷酸链，可与目标基因进行互补配对，所述电化学信号结合区为核苷酸链，其中电化学信号结合区尾端的核苷酸分子的磷酸根基团上连接一个氨基二茂铁分子。2.根据权利要求1所述的电化学探针，其特征在于：特异性结合区的长度为10
‑
40个核苷酸；所述电化学信号结合区长度为5
‑
20个核苷酸。3.根据权利要求1所述的电化学探针，其特征在于：所述特异性结合区与电化学信号结合区之间通过连接区连接，所述连接区为含有2
‑
20个乙二醇或者乙二胺分子的长链。4.根据权利要求1所述的电化学探针，其特征在于：所述特异性结合区用于检测人类源性...

【专利技术属性】
技术研发人员：关国良，陈巧玲，李琦，
申请(专利权)人：常州先趋医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：