一种同时检测引起低色素性贫血STEAP3基因突变和eSNP的试剂盒制造技术

本发明专利技术属于分子诊断领域，具体涉及一种同时检测引起低色素性贫血STEAP3基因突变和eSNP的试剂盒。该试剂盒中包含由引物对1

【技术实现步骤摘要】
一种同时检测引起低色素性贫血STEAP3基因突变和eSNP的试剂盒


[0001]本专利技术属于分子诊断领域，具体涉及一种同时检测引起低色素性贫血STEAP3基因突变和eSNP的试剂盒。

技术介绍

[0002]研究表明在中国南部地区，最为常见的导致先天性小细胞低色素贫血的遗传学因素为地中海贫血，其主要病因为HBA基因和/或HBB基因突变。但在临床诊断过程中，如果排除了地中海贫血基因突变，则还需要考虑其它基因变异所导致的低色素性贫血。
[0003]STEAP3基因是STEAP基因家族的成员之一，位于人类2号染色体上(2q14.2)，全长约42kb，在体内最常表达的转录本(NM_018234)所编码的mRNA全长为3915bp，分为6个外显子，前两个外显子和第三个外显子的前8bp共同剪接成5'UTR区，编码区由4个外显子(外显子3,4,5,6)组成，长1467bp，编码的肽链含488个氨基酸。STEAP3是红细胞内铁和铜离子的主要还原酶，并参与细胞对二者的摄入，铁离子摄入不足、代谢异常以及STEAP3基因功能性突变均可导致缺铁性贫血(缺铁性贫血属于低色素性贫血的常见类型)。例如，2005年Ohgami等人(Nature Genet.2005；37:1264
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1269)通过Steap3基因敲出的小鼠证明Steap3基因的缺失可以导致小鼠低色素性贫血。2011年Grandchamp等人(Blood.2011；118:6660
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6666)首次报道了一个巴基斯坦家系中的一个先天性低色素贫血患者，是由一个STEAP3无义突变(p.Cys100Ter)合并一个STEAP3低表达单倍体所导致，说明人类STEAP3基因的表达不足和突变可以导致铁过载型的低色素性贫血(OMIM：615234)。
[0004]已有研究表明STEAP3基因上的一些无义突变和错义突变可使STEAP3活性发生不同程度的下降，且STEAP3基因下游还存在一个单核苷酸多态性与STEAP3基因表达高低相关(eSNP：rs6721852)(Science.2015；348:648
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660.http://www.gtexportal.org/home/gene/STEAP3)，rs6721852的TT/TC/CC三种基因型分别对应STEAP3基因表达的高/中/低。
[0005]由于目前仍缺乏有效的临床检测方法同时对STEAP3基因进行突变筛查和eSNP进行分型，难以对低色素性贫血的患病风险进行预测。因此，本专利技术希望提出一种能同时检测STEAP3基因突变和eSNP的试剂盒，以满足实际需求。

技术实现思路

[0006]本专利技术旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术提出一种同时检测引起低色素性贫血STEAP3基因突变和eSNP的试剂盒。该试剂盒可针对STEAP3基因编码区所有未知突变进行筛查，并同时可对STEAP3基因的eSNP进行分型，具有通量高、操作简单、速度快、成本低、闭管操作、灵敏度高且特异性强的优势。
[0007]本专利技术提出一种同时检测引起低色素性贫血STEAP3基因突变和eSNP的引物组，包括引物对1
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7；
[0008]所述引物对1的上下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO:1
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2所示；所述引物对2的上
下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO:3
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4所示；所述引物对3的上下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO:5
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6所示；所述引物对4的上下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO:7
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8所示；所述引物对5的上下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO:9
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10所示；所述引物对6的上下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO:11
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12所示；所述引物对7的上下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO:13
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14所示。
[0009]其中，引物对1用于检测STEAP3基因外显子3区域a，引物对2用于检测STEAP3基因外显子3区域b，引物对3用于检测STEAP3基因外显子4区域a，引物对4用于检测STEAP3基因外显子4区域b，引物对5用于检测STEAP3基因外显子5区域，引物对6用于检测STEAP3基因外显子6区域，引物对7用于检测STEAP3基因下游的eSNP(rs6721852)。所设计的引物通过NCBI的BLAST功能对其特异性进行初步鉴定，通过普通PCR和Sanger测序确定了其特异性。筛查突变引物的位置相互覆盖，避免了筛查的“死角”。
[0010]本专利技术还提供了一种同时检测引起低色素性贫血STEAP3基因突变和eSNP的试剂盒，包括上述引物组。
[0011]优选地，所述试剂盒中还包括阴性质控品、eSNP(rs6721852)质控品、PCR缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶、LC Green染料、甜菜碱(Betain)、去离子水、DMSO和石蜡油。所述阴性质控品中含有野生型STEAP3基因，eSNP(rs6721852)质控品分别含有TT/TC/CC三种类型。
[0012]更优选地，所述DNA聚合酶为Taq DNA聚合酶。
[0013]本专利技术还提供了一种非诊断目的的同时检测引起低色素性贫血STEAP3基因突变和eSNP的检测方法，采用上述试剂盒进行检测，包括以下步骤：
[0014](1)采集外周血进行DNA抽提，得到样品DNA；
[0015](2)以所述样品DNA、阴性质控品和eSNP(rs6721852)质控品为模板DNA，分别加入PCR缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶、LC Green染料、甜菜碱、去离子水、DMSO、上下游引物对1、2、3、4、5、6或7，得到筛查STEAP3基因突变和eSNP分型的反应体系；
[0016](3)将所述反应体系加入至96孔板中，采用石蜡油进行液封后，进行PCR扩增；
[0017](4)待PCR扩增完成后，在高分辨率熔解曲线分析仪上进行荧光检测，得到HRM分析结果。
[0018]在步骤(4)的荧光检测过程中，DNA双链逐渐变性解开，LC Green染料从DNA分子双链上脱落下来，荧光值逐渐降低，仪器通过实时检测荧光值，建立荧光值随温度升高而下降得到的熔解曲线。通过比较样品DNA序列与阴性质控品的DNA之间熔解曲线的差异来判断待测样品有无突变；同时不同的熔链温度可以对eSNP进行分型。
[0019]优选地，步骤(2)中反应体系包括以下组分：PCR缓冲液2.0μL，2.5nM dNTPs 1.0μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.4μL，10μM上下游引物1.2μL，1
×
LC Green 2.0μL，模板DNA 1.5μL，5M甜菜碱4.0μL，DMSO 2.0μL，去离子水5.9μL。
[0020]优选地，步骤(3)中扩增反应的反应程序为：5℃预变性5分钟；95℃30秒本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种同时检测引起低色素性贫血STEAP3基因突变和eSNP的引物组，其特征在于，包括引物对1
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7；所述引物对1的上下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO:1
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2所示；所述引物对2的上下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO:3
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4所示；所述引物对3的上下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO:5
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6所示；所述引物对4的上下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO:7
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8所示；所述引物对5的上下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO:9
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10所示；所述引物对6的上下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO:11
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12所示；所述引物对7的上下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO:13
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14所示。2.一种同时检测引起低色素性贫血STEAP3基因突变和eSNP的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物组。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括阴性质控品、eSNP(rs6721852)质控品、PCR缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶、LC Green染料、甜菜碱、去离子水、DMSO和石蜡油。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述DNA聚合酶为Taq DNA聚合酶。5.一种非诊断目的的同时检测引起低色素性贫血STEAP3基因突变和...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘顿，陈创奇，吴远菲，易升，方萍，董云巧，张曦倩，刘风华，
申请(专利权)人：广东省妇幼保健院，
类型：发明
国别省市：