TRECs、KRECs和SMN1的检测试剂盒和检测方法技术

本发明专利技术涉及一种TRECs、KRECs和SMN1的检测试剂盒和检测方法。采用该试剂盒，能够实现SCID和SMA的联合检测。进一步地，基于这些引物对和探针，能够采用多重荧光定量PCR的方法，在一个荧光定量扩增体系中，实现对核酸样本中TRECs、KRECs和SMN1基因模板的特异扩增，通过进一步比较目的基因和内参基因CT值差异确定TRECs、KRECs和SMN1在单位数量的外周血细胞中的拷贝数，从而实现对SCID和SMA的快速、高效、灵敏检测。灵敏检测。灵敏检测。

【技术实现步骤摘要】
TRECs、KRECs和SMN1的检测试剂盒和检测方法


[0001]本专利技术涉及基因检测领域，尤其涉及一种TRECs、KRECs和SMN1的检测试剂盒和检测方法。

技术介绍

[0002]重症联合免疫缺陷病(SCID)是由多种遗传因素导致的一组罕见的先天性疾病，其特征表现为外周血淋巴细胞数减少(严重的淋巴细胞减少症)和低免疫球蛋白血症，该病导致体液免疫、细胞免疫同时存在严重缺陷，这种原发性免疫缺陷常被定义为初始T细胞缺乏。SCID的发生率约为1/10万活产新生儿，但因为SCID患儿常在明确诊断前死亡，该数字可能被严重低估。不经治疗，SCID的病死率为100％。至少有14种基因缺陷与SCID典型的表型相关，多呈性连锁隐形遗传，偶有常染色体隐形遗传及散发病例。根据基因缺陷的不同，SCID患者淋巴细胞表型可分为4类：T
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B+NK
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，T
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B
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NK
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，T
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B
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NK+，和T
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B+NK+。临床表现为患儿在出生最初数月发生一次或反复感染，严重威胁患儿生命和生活质量。
[0003]成熟的T、B淋巴细胞表面表达特异性的T、B细胞受体(TCR和免疫球蛋白Ig)，它们位于不同染色体上，基因座位通常由三类基因元件构成(可变区(V)，多变区(D)，和连接区(J))。T、B细胞成熟过程中，位于V区下游、D区两端、J区上游的重组信号序列(RSS)通过重组事件实现(V
‑/>D
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J)基因重排，重组元件之间的序列通过首尾相连形成环状结构从染色体中被删除，分别形成T细胞受体切除环(TRECs)、和B细胞受体切除环(KRECs)。例如：TCRα链编码基因成熟过程中，通过(V)α与(J)α间的基因重组，将(TCR)δ链编码基因删除(形成δRec
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ψJαTREC环)；B细胞受体的轻链包括κ和λ链两种，表达λ链的B细胞在成熟过程中，λ链编码基因重排时间导致κ链编码基因Cκ和κ增强子序列的删除，形成κ重组删除环(sjKRECs)。作为T、B细胞发育分化的副产品，这些染色体外环状DNA结构稳定，但不能继续分裂，并随着T、B细胞的分裂被逐渐稀释。新生儿发育早期，淋巴细胞群体里TREC环的拷贝数可作为判断胸腺输出初始T淋巴细胞功能的可靠指标。类似的，淋巴细胞群体里KREC环的拷贝数也可作为衡量周围淋巴器官B细胞增殖的生物标记物。
[0004]Chan和Puck在2005年首先报道了采用实时定量PCR方法检测T细胞受体切除环。2014年美国FDA批准了PerkinElmer的EnLite Neonatal TREC Kit，这是首个获批上市的检测新生儿重症综合性免疫缺陷(SCID)的试剂盒。该试剂盒采用多重荧光定量PCR，从新生儿脚后跟获取几滴血液，检测新生儿基因组中的T细胞受体切除环DNA序列(TREC DNA)是否降低或缺失，这是患有SCID的新生儿的特征。目前，多个国家已经开展了新生儿SCID筛查工作，然而，临床的筛查效率及灵敏度有待提升。因此，建立一个快速、高效、敏感的SCID筛查技术体系具有非常重要的意义。
[0005]脊髓性肌萎缩症(Spinal Muscular Atrophy,SMA)是一种常染色体隐性遗传的神经肌肉疾病，对于新生儿的身体健康和以后正常生活都会造成很大的影响，甚至会影响到寿命，是2岁以下婴幼儿死亡的主要遗传原因。通过新生儿筛查早期发现SMA，对于进行症状前治疗和确保患者获得最佳预后至关重要。SMA一般可通过血清肌酸激酶、肌活检、肌电图
以及基因检测等检查进行明确。根据SMA患者的发病年龄和临床表现分为4型：I型(严重型)、II型(中间型)，III型(轻型)和IV型(成人型)。SMA的致病基因定位于五号染色体5q11.2
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5q13.2区域，在该区域上的两个高度同源的基因被命名为运动神经元存活基因(survival motor neuron,SMN)。其中靠近端粒的SMN1是SMA的致病性基因；靠近中心体的SMN2不是SMA致病性基因，但其拷贝数与SMA临床表现严重程度相关。95％的SMA I型患者其症状由携带有SMN1基因7号外显子的纯合缺失突变导致。通过实时荧光定量PCR的方法对SMN1 7号外显子靶位点进行检测，可实现对人细胞中正常SMN1基因拷贝数的定量。若平均每个细胞中有2个拷贝的正常SMN1基因则为完全正常者、若平均每个细胞只有1个正常的SMN1基因则为携带者，若细胞中无正常的SMN1基因则为SMA患者。与其他检测方法相比，qPCR检测方法具有耗时短，设备成本低，检测灵敏度高等优势。新生儿疾病筛查(新筛)是指在新生儿期对严重危害新生儿健康的先天性、遗传性疾病施行专项检查。新筛一般是通过实验室方法检测滤纸干血片相关指标来实现的。在新生儿出生后72小时内采集足跟血制作的干血斑样本已被成功用于包括苯丙酮尿症(PKU)、先天性甲状腺功能减低(CH)、先天性肾上腺皮质增生症(CAH)、葡萄糖
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磷酸酶缺乏症(G6PD)在内的一系列新筛项目。由于新生儿干血斑样本量有限(只有几十微升)，对后端检测技术的灵敏度要求非常高。随着新筛项目的增加和全国筛查率的提高，使用同一个样本同时对几种遗传疾病进行筛查已成为这一领域的发展趋势。
[0006]目前，还没有一种SCID和SMA的联合检测产品。有鉴于此，特提出本申请。

技术实现思路

[0007]本申请的目的之一包括提供一种检测试剂盒，该检测试剂盒包括检测TRECs、KRECs和SMN1基因的引物对和探针，采用该检测试剂盒，能够实现SCID和SMA的联合检测。
[0008]本申请的目的可以通过以下技术方案实现：
[0009]在本申请的第一方面，提供一种检测试剂盒，所述检测试剂盒包括检测TRECs的引物对1和探针1、检测KRECs的引物对2和探针2、以及检测SMN1基因的引物对3和探针3，或者还包括检测内参基因的内参引物对及内参探针；
[0010]其中，
[0011]所述引物对1的扩增产物1与如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示的引物对的扩增产物相同，所述探针1特异识别所述扩增产物1上的TREC环重组连接位点，
[0012]所述引物对2的扩增产物2与如SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示的引物对的扩增产物相同，所述探针2特异识别所述扩增产物2上的KREC环重组连接位点，
[0013]所述引物对3的扩增产物3与SEQ ID No.17和SEQ ID No.19所示的引物对的扩增产物相同，所述探针3特异性识别所述扩增产物3上的SMN1基因的SNP位点。
[0014]在本申请的一些实施方式中，所述检测试剂盒具有如下技术特征中的一个或者多个：
[0015](1)所述引物对1具有SEQ ID No.2所示的上游引物1和SEQ ID No.3所示的下游引物1；本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括检测TRECs的引物对1和探针1、检测KRECs的引物对2和探针2、以及检测和SMN1基因的引物对3和探针3，或者还包括检测内参基因的内参引物对及内参探针；其中，所述引物对1的扩增产物1与如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示的引物对的扩增产物相同，所述探针1特异识别所述扩增产物1上的TREC环重组连接位点，所述引物对2的扩增产物2与如SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示的引物对的扩增产物相同，所述探针2特异识别所述扩增产物2上的KREC环重组连接位点，所述引物对3的扩增产物3与SEQ ID No.17和SEQ ID No.19所示的引物对的扩增产物相同，所述探针3特异性识别所述扩增产物3上的SMN1基因的SNP位点。2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒具有如下技术特征中的一个或者多个：(1)所述引物对1具有SEQ ID No.2所示的上游引物1和SEQ ID No.3所示的下游引物1；(2)所述引物对2具有SEQ ID No.6所示的上游引物2和SEQ ID No.7所示的下游引物2；和，(3)所述引物对3具有SEQ ID No.17所示的上游引物3和SEQ ID No.19所示的下游引物3。3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述上游引物3的第15位和第23位核苷酸具有LNA修饰，所述下游引物3的第13位核苷酸具有LNA修饰。4.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒具有如下技术特征中的一个或者多个：(1)所述探针1如SEQ ID No.4所示；(2)所述探针2如SEQ ID No.8所示；和，(3)所述探针3如SEQ ID No.24所示。5.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述探针3的第12位和第14位核苷酸具有LNA修饰。6.根据权利要求1至5任一项所述的检测试剂盒，其特征在于，所述内参基因为人的RPP30基因。7.根据权利要求1至5任一项所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测探针和所述内参探针各自独立地标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团，且不同检测探针之间以及检测探针和内参探针之间所标记的荧光报告基团不同。8.基于非诊断目的的TRECs、KRECs和SMN1基因的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：采用权利要求1至7任一项所述的检测试剂盒对待测核酸样本进行检测，根据检测结果判断所述待测核酸样本中TRECs、KRECs和SMN1基因的拷贝数是否异常。9.根据权利要求8所述的基于非诊断目的的TRECs、KRECs和SMN1基因的检测方法，其特征在于，扩增的退火温度为58℃
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62℃。10.根据权利要求9或者10所述的基于非诊断目的的TRECs、KRECs和SMN1基因的检测方法，其特征在于，根据检测结果判断所述待测核酸样本中TRECs、KRECs和SMN1基因的拷贝数
是否异常，包括：将所述探针1、所述探针2和所述内参探针对应的Ct值分别记作Ct
检测1...

【专利技术属性】
技术研发人员：张巍，田辉，
申请(专利权)人：嘉检广州生物工程技术有限公司，
类型：发明
国别省市：