一株猫冠状病毒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一株猫冠状病毒，分类命名为猫冠状病毒(Feline Coronavirus)FCoV/WH/2022

【技术实现步骤摘要】
一株猫冠状病毒及其应用


[0001]本专利技术属于生物领域，涉及一株猫冠状病毒(Feline Coronavirus,FCoV)及其应用。

技术介绍

[0002]猫传染性腹膜炎(Feline Infectious Peritonitis，FIP)是一种猫的渐进性、致死性传染病，主要发于2岁以下的猫及多猫环境。除了感染家猫之外，貂、老虎、猎豹、狮子等野生猫科动物亦见FIP。患病猫的一般临床症状包括嗜睡、厌食、体重减轻、发热、黄疸、腹部膨大、呼吸急促、淋巴结肿大、黏膜苍白、葡萄膜炎、共济失调、癫痫发作等。在发病猫的血液、渗出液、脑脊液、房水、组织(肝、脾、肾、肠系膜淋巴)均可检测到病毒存在。FIP的病原体是猫冠状病毒(Feline Coronavirus,FCoV)。
[0003]猫冠状病毒是有囊膜的、单股正链RNA病毒，隶属于冠状病毒科、冠状病毒属、尼多目病毒科。病毒粒子表面有刺突状纤突，病毒基因组大小约为30Kb。根据致病性不同，猫冠状病毒又被分为猫肠道冠状病毒(Feline Enteric Coronavirus,FECV)和猫传染性腹膜炎病毒(Feline Infectious Peritonitis Virus,FIPV)两种生物型，FECV感染仅引起轻微的、自限性的肠炎，FECV组织嗜性改变使其突变为FIPV，进而引起致命的FIP。根据病毒S蛋白的差异，猫冠状病毒又可以分为Ⅰ型和Ⅱ型两种血清型。Ⅱ型FCoV能够使用常见猫细胞系进行分离培养，是开展FCoV研究的主要材料。受限于合适的细胞系和未知的病毒受体，流行率更高(>90％)的Ⅰ型猫冠状病毒分离培养困难，因此缺乏自然的Ⅰ型FIPV动物模型。
[0004]对FIPV的分子流行病学调查并不鲜见，但由于分离培养困难而缺乏FIPV攻毒模型。在动物水平对抗猫冠状病毒药物进行评估，只能依赖于广泛收集临床病例，大大影响了动物实验准确度和精密度。Wang等人通过反向遗传系统，将II型FIPV S蛋白胞外域替换到I型FIPV上，拯救出一株重组FIPV，建立了FIP口服感染模型(Wang et al2021)。但该重组病毒本质上属于Ⅱ型FIPV，不能完全反映占绝大多数的(>90％)Ⅰ型FIP病例。
[0005]经过资料的查询和信息的核对，目前尚无Ⅰ型FIPV动物模型，主要原因在于缺乏可用于攻毒并产生临床症状的毒株。因此亟需稳定、可靠、接近自然发病的Ⅰ型FIP动物模型，应用于FIPV相关疫苗、药物的研发，这对现有技术中存在的问题的解决具有重大的科学意义与应用价值。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一株猫传染性腹膜炎病毒Ⅰ型毒株，该毒株可以引起动物产生典型的FIP症状和病理变化，进而可用于构建攻毒模型并用于抗FIPV相关药物或疫苗的研究，旨在解决现有毒株无法构建Ⅰ型FIPV动物模型的问题。
[0007]为实现上述目的，申请人从武汉市洪山区某动物医院的FIP病猫中筛选到一株猫冠状病毒，通过对该病毒的结构基因进行测序比对，发现其与目前所报道的I型FCoV相似性最高，因此鉴定该病毒属于血清型Ⅰ型猫传染性腹膜炎病毒。该病毒已于2022年11月10日送
交中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为：CCTCC NO:V202297，分类命名为猫冠状病毒(Feline Coronavirus)FCoV/WH/2022
‑
1，保藏地址：中国武汉。
[0008]申请人将含有病毒的腹水腹腔注射回归至健康实验猫，发现动物产生明显FIP症状和病理变化，而将另外收集的30余份FCoV核酸阳性FIP病例腹水回归到实验动物猫却不能引起FIP而实现病毒复壮，初步证明本专利技术筛选的毒株在导致FIP症状方面的表现不同于现有大多数毒株。接着，申请人将毒株S蛋白与此前报道的多株I型FCoV进行比对，发现S蛋白序列最高相似性仅为92.70％，在第Phe5、Arg13、Glu33、Gly65、Lys79、Arg128、Tyr234、Gln237位等多处氨基酸位点发生变异，这可能是导致以上表型差异的原因之一。
[0009]申请人制备了5.275拷贝数/1uL的组织病毒液，将其倍比稀释后对实验猫腹腔注射攻毒，得到该毒株的半数致死剂量(LD
50
)为0.5275copies。攻毒后的实验猫体温上升，体重减轻，血液淋巴细胞下降，血清淀粉样蛋白水平升至明显炎症水平，剖检可见病死猫有典型FIP症状，腹腔大量淡黄色粘稠积液，肝脏表面黄白色结节，脾脏表面不平整，肠系膜及肠壁有结节，免疫组化诊断到病死猫病变组织器官有FCoV N蛋白阳性信号。至此，使用该病毒成功构建了Ⅰ型FIPV动物模型，症状和病理特征均与临床FIP相同。
[0010]最后，申请人利用构建的动物模型进行了药物筛选试验，进一步验证了该模型的可靠性，可以用于评价抗猫冠状病毒药物。
[0011]本专利技术的有益效果是：
[0012]Ⅰ型FCoV对外界环境抵抗力差，很难在体外对其进行分离和传代培养，同时其受体结合域容易发生变异，感染力不稳定，导致Ⅰ型FCoV很难感染动物产生与临床FIP相同的症状和病理特征。本专利技术针对现有技术缺乏Ⅰ型FIPV动物模型以及用于构建该模型的毒株，通过大量试验筛选，得到一株能引起动物产生典型FIP症状和病理变化，能稳定构建Ⅰ型FIPV动物模型的毒株，该毒株在FIPV相关疫苗、药物的研发中具有重大的科学意义与应用价值。
附图说明
[0013]图1为PCR检测腹水病料中FCoV的特异性条带电泳图，其中，1：阴性对照，2:FCoV/WH/2022
‑
1,M:2000bp DNAMarker；
[0014]图2为FCoV/WH/2022
‑
1与4株I型FCoV的S蛋白序列比对，左侧编码为毒株序列登录号。
[0015]图3为不同稀释度的FCoV/WH/2022
‑
1组织毒攻毒后实验猫的生存曲线；100、10
‑1、10
‑2、10
‑3、10
‑4、10
‑5为组织毒原液稀释倍数，对应稀释度的病毒拷贝数为5275copies/mL、527.5copies/mL、52.75copies/mL、5.275copies/mL、0.5275copies/mL、0.05275copies/mL，每个稀释度以1mL量腹腔注射攻毒。Blank组以攻入等量的FCoV阴性的猫肝组织匀浆上清。
[0016]图4为不同稀释度的FCoV/WH/2022
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1组织毒攻毒后实验猫相对于第0天的体重变化。
[0017]图5为不同稀释度的FCoV/WH/2022
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1组织毒攻毒后实验猫的体温变化。猫的正常体温范围是38.5℃到39.5℃。
[0018]图6为FCoV/WH/2022
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1组织毒攻毒前后发病猫与无症状猫血液淋巴细胞数量变化，攻毒后血液淋巴细胞明显减少。猫血液淋本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株猫冠状病毒，分类命名为猫冠状病毒(Feline Coronavirus)FCoV/WH/2022
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1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:V202297，该病毒为血清型Ⅰ型猫传染性腹膜炎病毒(Feline Infectious Peritonitis Virus)。2.如权利要求1所述的猫冠状病毒，其特征在于，该病毒的S基因核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。3.权利要求1所述的病毒在制备猫冠状病毒药物筛选模型中的应用。4.一种猫冠状病毒药物筛选模型的制备方法，其特征在于包括以下步骤：...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭贵青，胡小帅，沈洲，陈奕熹，焦哲，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：