一种牛疱疹病毒4型毒株及其培养方法和应用技术

一种牛疱疹病毒4型毒株及其培养方法和应用，命名为DN01，该病毒已于2021年12月28日在中国典型培养物保藏中心进行的保藏，保藏编号为CCTCC NO:V202193。该病毒对犊牛具有较强致病力，能引起肾脏、肝脏、肺脏、脾脏、阴道和子宫等器官的病变；同时具备良好的免疫原性，可诱发母牛产生抗体；根据本发明专利技术中的病毒制备的高滴度的血清抗体，具有较好的血清效价。具有较好的血清效价。具有较好的血清效价。

【技术实现步骤摘要】
一种牛疱疹病毒4型毒株及其培养方法和应用


[0001]本专利技术涉及分子生物
，特别是一种牛疱疹病毒4型毒株及其培养方法和应用。

技术介绍

[0002]牛疱疹病毒(Bovine herpesvirus，BHV
‑
4)属于疱疹病毒科，丙型疱疹病毒亚科，猴病毒属，在国内和国外牛场中均有蔓延。这种病毒在患有结膜炎、肺炎和上呼吸道炎症、肠炎、皮肤病损、乳房皮炎、产后子宫炎、慢性子宫炎的牛身上皆有分离到。另外，BHV
‑
4还与流产相关，在流产胎儿中有同时发现牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和BHV
‑
4。该病多为牛的隐性感染，结合其他病原一起发病，可能使临床症状加剧，且表现多样化，给诊断和治疗带来较大困难，对养牛业构成严重威胁。
[0003]由于该病感染多为隐性感染，合并其他病原感染后的临床表现多样化，难以通过临床观察作出诊断，因此，需要依靠实验室检测进行确诊，如病毒的分离鉴定，血清学诊断，以及分子生物学检测。目前对于BHV
‑
4的诊断研究的较少，因此寻找一个具有较好免疫原性的毒株对于BHV
‑
4的预防措施及诊断方法的研制有重大的意义。

技术实现思路

[0004]解决的技术问题：为了克服现有技术的不足，本专利技术提供一种牛疱疹病毒4型毒株及其培养方法和应用。该病毒可在MAC
‑
T细胞中增殖，通过该病毒制得的灭活和纯化病毒可诱发母牛产生抗BHV
‑
4的抗体；且制备的血清抗体，具有较好的血清效价。
[0005]技术方案：一种牛疱疹病毒4型毒株，命名为DN01，该病毒已于2021年12月28日在中国典型培养物保藏中心进行的保藏，保藏编号为CCTCC NO:V202193。
[0006]编码所述病毒的DNA分子，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0007]上述牛疱疹病毒4型毒株的培养方法，所述病毒感染MAC
‑
T细胞后，37℃，5％ CO2培养箱中培养，当细胞病变达80％以上时，收获病毒液。
[0008]一种牛疱疹病毒BHV
‑
4疫苗，含有上述毒株。
[0009]一种牛疱疹病毒BHV
‑
4疫苗，含有上述DNA分子。
[0010]如下(1)
‑
(2)任一项在制备疫苗制剂中的用途：(1)所述的牛疱疹病毒4型毒株；(2)权利要求2所述的DNA分子。
[0011]有益效果：本专利技术中的病毒DN01可在MAC
‑
T细胞中增殖，病毒浓度可达107TCID
50
/mL，无外源病毒污染；本专利技术中的病毒DN01对牛具有致病力，病毒感染了犊牛之后产生了肾脏、肝脏、肺脏、脾脏、阴道和子宫等器官的病变；根据本专利技术中的病毒DN01制备的灭活和纯化病毒可诱发母牛产生抗BHV
‑
4的抗体；根据本专利技术中的病毒DN01制备的血清抗体，具有较好的血清效价。
附图说明
[0012]图1为本专利技术中BHV
‑
4的电镜观察图。
[0013]图2为本专利技术中各器官组织病理学观察图。
具体实施方式
[0014]下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步详细说明。
[0015]若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0016]实施例1病毒的分离培养和鉴定
[0017](1)病毒的分离
[0018]2020年底采集自河北某养殖场发病牛的粪便样本，低温运输至实验室。用MAC
‑
T细胞(牛乳腺上皮细胞)培养法对样本进行病毒分离，培养三代后细胞出现细胞融合，进行病毒分离，获得病毒DN01,该病毒已于2021年12月28日在中国典型培养物保藏中心进行的保藏，保藏编号为CCTCC NO:V202193，保藏地址为中国湖北省武汉市武昌区八一路299号，武汉大学。
[0019](2)病毒的鉴定
[0020]1.基因组序列分析
[0021]对该病毒的基因组序列进行分析，全基因序列为SEQ ID No.1所示的序列(见序列表)。
[0022]2.电镜检查
[0023]在电镜下观察牛疱疹病毒4型DN01，如图2所示，病毒颗粒直径范围在150nm左右，表面有囊膜。
[0024]3.无菌、支原体检测
[0025]按照《中国兽药典》方法对该病毒进行无菌、支原体检查，结果表明无支原体和其它微生物污染。
[0026]4.病毒滴度检测
[0027]采用微量滴定法测定该株病毒的病毒浓度，方法如下：用96孔细胞培养板培养MAC
‑
T细胞，将病毒用细胞维持液从10
‑1倍比稀释至10
‑8，分别将每个稀释度的病毒液接种100μL/孔，每个稀释度接种8孔，将对数生长期的MAC
‑
T细胞稀释至3
×
106个细胞/mL，每个细胞孔中接种100μL，同时设细胞对照孔。置37℃，5％CO2培养箱中培养，4
‑
6天观察细胞感染病毒情况，计算病毒浓度，病毒浓度达107TCID
50
/mL。
[0028]实施例2DN01毒株的致病力
[0029]将4头试验犊牛随机分成2组，检测其牛疱疹病毒4型均为阴性。第1组接种107TCID
50
的病毒DN01，第2组接种4mL DMEM作为阴性对照组，接种方式为鼻腔接种。
[0030]接种后14天内，每天测量体温2次，记录临床症状，采集鼻拭子、眼拭子和肛门拭子进行病毒检测。在接种后第18天确定鼻腔停止排毒后，安乐死所有的实验牛，采集组织器官等样本，作组织病理学观察。结果显示对照组各器官正常，而实验组各器官病变程度如下(图2)：
[0031]肾脏：肾小球囊腔浆液和红细胞渗出，肾小管蛋白管型，间质结缔组织增生，肾小
管上皮细胞变性坏死，淋巴细胞为主的炎性细胞浸润。
[0032]肝脏：肝细胞脂肪变性。
[0033]肺脏：肺脏支气管性肺炎，部分支气管黏膜坏死脱落，腔内大量细胞堆积。
[0034]脾脏：脾脏出血，并见有大量中性细胞浸润。
[0035]阴道：阴道黏膜坏死，血管充血，大量中性细胞、浆细胞、巨噬细胞、淋巴细胞等炎性细胞浸润。
[0036]子宫：子宫黏膜坏死，大量中性细胞、浆细胞、巨噬细胞、淋巴细胞等炎性细胞浸润，部分巨噬细胞空泡化，胞浆见有红染圆形蛋白物质。
[0037]实施例3母牛免疫原性试验
[0038](1)病毒培养
[0039]复苏MAC
‑
T细胞，经扩增，至细胞长至薄单层后，将病毒DN01接种至细胞瓶内，37℃，5％CO2培养箱中培养，每天观察细胞病变，当细胞病变达80％以上时，收获病毒液，
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种牛疱疹病毒4型毒株，命名为DN01，该病毒已于2021年12月28日在中国典型培养物保藏中心进行的保藏，保藏编号为CCTCC NO:V202193。2.编码权利要求1 所述病毒的DNA分子，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示。3.权利要求1所述牛疱疹病毒4型毒株的培养方法，其特征在于，所述病毒感染MAC
‑
T细胞后，37℃，5% CO2培养箱中培养，当...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜菊，王娟芳，俞菊仙，
申请(专利权)人：大能生物科技南京有限公司，
类型：发明
国别省市：