眼底新生血管性疾病检测生物标记物、检测试剂盒及应用制造技术

本发明专利技术属于生物医学检测技术领域，公开了一种眼底新生血管性疾病检测的生物标记物、检测试剂盒及应用，眼底新生血管性疾病检测的生物标记物为tRNA衍生片段tRF

【技术实现步骤摘要】
眼底新生血管性疾病检测生物标记物、检测试剂盒及应用


[0001]本专利技术属于生物医学检测
，尤其涉及一种眼底新生血管性疾病检测的生物标记物、检测试剂盒及应用。

技术介绍

[0002]眼底新生血管性疾病是一组以眼底病理性血管新生为特征的疾病，可在不同年龄阶段发生，如新生儿早产儿视网膜病变(ROP)、中年人增殖性糖尿病视网膜病变(PDR)和老年人年龄相关性黄斑变性(AMD)，严重威胁人类视力，现已成为全球公共卫生问题和社会经济负担。该类疾病重要病理学特点是：血管屏障受损、血管闭塞无灌注、病理性血管新生和继发出血渗漏，继而导致失明。
[0003]目前针对该类疾病的主要治疗手段包括：全身治疗、眼底激光光凝、眼内注射药物、玻璃体切割手术等。这些治疗方式主要针对晚期病变，均存在较多不足和相对副作用。作为非破坏性治疗，眼内注射抗VEGF药物成为目前抗新生血管治疗的主流。然而，部分患者对抗VEGF药物治疗无效甚至出现视网膜萎缩等副作用。因此，挖掘其发病的调控机制，寻找灵敏且应用方便的检测标记物和新型治疗靶标，有助于眼底新生血管性疾病早期诊断和防治。
[0004]tRNA片段是通过pre
‑
tRNA和成熟tRNA的内核裂解产生的一组不编码功能蛋白的非编码RNA，参与转录和转录后水平调控基因表达，包括核糖体生物发生、翻译抑制、mRNA稳定性抑制等。此外，tRNA片段在核糖体生物发生、表观遗传调控、翻译抑制、mRNA稳定性抑制等诸多生物学过程中发挥重要作用。tRNA片段参与人类多种生物过程和疾病发生，其异常调控与饮食诱导的代谢紊乱和癌症进展等显著相关。鉴于tRNA片段的特征和疾病相关性，其有望成为诊断的标志物和预后评估的标记。
[0005]通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：
[0006](1)眼底新生血管性疾病的早期诊断至关重要，然而现有技术难以做到早期特异性诊断，且缺少创伤性小的早期诊断方法。
[0007](2)目前针对眼底新生血管性疾病的治疗方式主要针对晚期病变，均存在较多不足和相对副作用。
[0008](3)眼内注射抗VEGF药物是目前抗新生血管治疗的主流，但是部分患者对抗VEGF药物治疗无效甚至出现视网膜萎缩等副作用。

技术实现思路

[0009]针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种眼底新生血管性疾病检测的生物标记物、检测试剂盒及应用，尤其涉及一种基于实时荧光定量PCR技术检测眼底新生血管性疾病的生物标记物、检测试剂盒及应用。
[0010]本专利技术是这样实现的，一种眼底新生血管性疾病检测的生物标记物，所述眼底新生血管性疾病检测的生物标记物为tRNA衍生片段tRF
‑
1001，所述眼底新生血管性疾病检测
的生物标记物的核苷酸序列为SEQ ID NO：1。
[0011]本专利技术的另一目的在于提供一种应用所述的眼底新生血管性疾病检测的生物标记物的眼底新生血管性疾病实时荧光定量PCR检测试剂盒，所述眼底新生血管性疾病实时荧光定量PCR检测试剂盒包括PCR扩增体系，所述PCR扩增体系包括SYBR Premix Ex Taq 2
×
100μL，tRF
‑
1001特异性的qRT
‑
PCR上游引物，tRF
‑
1001特异性的qRT
‑
PCR下游引物，GAPDH定量PCR上游引物，GAPDH定量PCR下游引物，引物各1管，10μM，100μL/管。
[0012]进一步，所述SYBR Premix Ex Taq 2
×
包括Ex Taq酶，dNTP Mixture，Mg
2+
，Tli RNaseH，TB Green。
[0013]进一步，所述GAPDH定量PCR上游引物核苷酸序列为SEQ ID NO：2，下游引物核苷酸序列为SEQ ID NO：3；所述tRF
‑
1001特异性的qRT
‑
PCR上游引物核苷酸序列为SEQ ID NO：4，下游引物核苷酸序列为SEQ ID NO：5；RNA反转录随机引物为GAPDH定量PCR引物序列。
[0014]进一步，所述眼底新生血管性疾病实时荧光定量PCR检测试剂盒还包括反转录反应体系，所述反转录反应体系包括总RNA反转录引物，1管，50μM，50μL/管；反转录酶，200U/μL，50μL；dNTP Mixture，10mM each 50μL；反转录buffer50μL。
[0015]进一步，所述总RNA反转录引物包括Oligo dT和Random 6mers。
[0016]进一步，所述眼底新生血管性疾病实时荧光定量PCR检测试剂盒还包括RNA抽提体系，所述RNA抽提体系包括Trizol reagent，1管，2000μL/管；氯仿，1管，500μL/管；无水乙醇，1管，8000μL/管；DEPC ddH2O，1管，1000μL/管；ddH2O，1管，2000μL/管；异丙醇，8000μL/管。
[0017]本专利技术的另一目的在于提供一种实施所述的眼底新生血管性疾病检测的生物标记物的眼底新生血管性疾病检测的生物标记物的筛选方法，所述眼底新生血管性疾病检测的生物标记物的筛选方法包括以下步骤：
[0018]步骤一，样本准备：收集湿性年龄相关性黄斑变性患者的房水标本和老年性白内障患者房水标本，RNA采用TRIzol试剂提取，并保存于
‑
80℃备用；
[0019]步骤二，以湿性年龄相关性黄斑变性患者房水标本为实验组，老年性白内障患者房水标本为对照组，采用反转录试剂盒进行total RNA的逆转录；
[0020]步骤三，采用定量PCR验证芯片分析的实验结果，验证靶点tRF
‑
1001在湿性年龄相关性黄斑变性患者以及白内障患者房水中的表达差异。
[0021]本专利技术的另一目的在于提供一种所述的眼底新生血管性疾病检测的生物标记物在制备眼底新生血管性疾病诊断试剂中的应用。
[0022]本专利技术的另一目的在于提供一种所述的眼底新生血管性疾病检测的生物标记物在制备眼底新生血管性疾病治疗后的预后评估试剂中的应用。
[0023]结合上述的技术方案和解决的技术问题，请从以下几方面分析本专利技术所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：
[0024]第一、针对上述现有技术存在的技术问题以及解决该问题的难度，紧密结合本专利技术的所要保护的技术方案以及研发过程中结果和数据等，详细、深刻地分析本专利技术技术方案如何解决的技术问题，解决问题之后带来的一些具备创造性的技术效果。具体描述如下：
[0025]本专利技术提供了一种眼底新生血管性疾病检测生物标记物、检测试剂盒及应用，公开了tRF
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1001在白内障和眼底新生血管性疾病患者房水中的表达情况，包括实时荧光定量
PCR检测tRF
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1001的方法，为眼底新生血管性疾病的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种眼底新生血管性疾病检测的生物标记物，其特征在于，所述眼底新生血管性疾病检测的生物标记物为tRNA衍生片段tRF
‑
1001，所述眼底新生血管性疾病检测的生物标记物的核苷酸序列为SEQ ID NO：1。2.一种应用如权利要求1所述的眼底新生血管性疾病检测的生物标记物的眼底新生血管性疾病实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述眼底新生血管性疾病实时荧光定量PCR检测试剂盒包括PCR扩增体系，所述PCR扩增体系包括SYBR Premix Ex Taq 2
×
100μL，tRF
‑
1001特异性的qRT
‑
PCR上游引物，tRF
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1001特异性的qRT
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PCR下游引物，GAPDH定量PCR上游引物，GAPDH定量PCR下游引物，引物各1管，10μM，100μL/管。3.如权利要求2所述的眼底新生血管性疾病实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述SYBR Premix Ex Taq 2
×
包括Ex Taq酶，dNTP Mixture，Mg
2+
，Tli RNaseH，TB Green。4.如权利要求2所述的眼底新生血管性疾病实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述GAPDH定量PCR上游引物核苷酸序列为SEQ ID NO：2，下游引物核苷酸序列为SEQ ID NO：3；所述tRF
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1001特异性的qRT
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PCR上游引物核苷酸序列为SEQ ID NO：4，下游引物核苷酸序列为SEQ ID NO：5；RNA反转录随机引物为GAPDH定量PCR引物序列。5.如权利要求2所述的眼底新生血管性疾病实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述眼底新生血管性疾病实时荧光...

【专利技术属性】
技术研发人员：颜标，蒋沁，姚牧笛，马严，朱妍，赵雅，
申请(专利权)人：南京医科大学眼科医院，
类型：发明
国别省市：