抗虫蛋白Cry1F杂交瘤细胞株及其产生的抗体和应用制造技术

本发明专利技术公开了Cry 1F杂交瘤细胞株1D7 1C6和1F7 1D8及其产生的抗体和应用，所述杂交瘤细胞株1D7 1C6和1F7 1D8，已依次于2021年12月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.45008和45009，其制备方法包括：a)纯化转基因玉米种子中Cry 1F蛋白；b)将Cry 1F蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠；c)收集免疫BALB/c小鼠的脾细胞并与SP2/0细胞进行融合；d)通过有限稀释法进行亚克隆，亚克隆5

【技术实现步骤摘要】
抗虫蛋白Cry 1F杂交瘤细胞株及其产生的抗体和应用


[0001]本专利技术涉及生物工程领域，具体涉及到抗虫蛋白Cry 1F杂交瘤细胞株1D7 1C6和1F7 1D8及其产生的抗体和应用。

技术介绍

[0002]苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)是一种广泛存在的革兰氏阳性菌，该菌分泌的抗虫晶体蛋白是目前主要的生物农药；分泌的抗虫蛋白按照氨基酸序列相似性被分为两类：Cry和Cryδ
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内毒素。其中Cry蛋白对多种有害昆虫(如鳞翅目，双翅目，鞘翅目，线虫类和原生生物等)幼虫具有毒性。Cry毒素已经被转入农作物使其具有抗虫性。Cry 1F蛋白是Cry毒素中的一种。目前转Cry基因的农作物主要有玉米、土豆、水稻、棉花等。
[0003]转基因技术的发展与进步推动了生物学的发展。转基因食品虽然能够满足人们对产量、抗虫性等方面的要求，但同时也对人类的生活带来了一些潜在的威胁，如某些基因导入宿主之后会使食品产生毒性，转基因食物产生过敏原，使人产生抗药性，食品的营养价值发生改变等。在进行转基因食品研究开发和商业化的同时，为了对转基因食品的安全性给予综合评估，使消费者能够快速区分转基因食品与天然食品，建立合适的方法对转基因食品中转基因成分进行鉴定与检测，能够促进农业转基因生物安全管理，保障人和动物以及微生物的安全，同时能够保护生态环境，促进农业转基因生物技术的进一步研究。为了对转基因作物及其衍生物中Cry 1F蛋白进行快速分析，研究并得到抗Cry 1F蛋白的单克隆抗体具有非常大的意义。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供两种杂交瘤细胞株1D7 1C6和1F7 1D8及其产生的抗体和制备方法，其分泌的单抗为实现抗虫蛋白Cry 1F在转基因作物中的检测奠定基础。
[0005]为实现上述目的，本专利技术提供了杂交瘤细胞株，包括于2021年12月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的生物保藏编号为CGMCC No.45008和CGMCC No.45009的杂交瘤细胞株1D7 1C6和1F7 1D8。
[0006]具体的，杂交瘤细胞株的制备方法包括以下步骤：
[0007]a)纯化转基因玉米种子中Cry 1F蛋白；
[0008]b)免疫动物：将Cry 1F蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠；
[0009]c)细胞融合：收集免疫BALB/c小鼠的脾细胞并与SP2/0细胞进行融合；
[0010]d)细胞建株：通过有限稀释法进行亚克隆，亚克隆5
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7天进行ELISA检测，直至筛选出稳定分泌阳性抗体的杂交瘤细胞株进行扩大再培养和保存。
[0011]其中，小鼠的脾细胞与SP2/0细胞的融合比例为1:5
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1:10。
[0012]本专利技术还提供一种前述的杂交瘤细胞株所产生的单克隆抗体，将杂交瘤细胞株接种到小鼠腹腔中制备腹水，然后进行Protein A
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琼脂糖亲和层析柱纯化，得到单克隆抗体。
[0013]具体的，杂交瘤细胞株1D7 1C6和1F7 1D8所产生的单克隆抗体通过间接ELISA检
测所得到的效价分别为1:6140000和1:2050000，抗体的类型分别为IgG1和IgG2b。
[0014]杂交瘤细胞株1D7 1C6所产生的单克隆抗体可变区重链氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示序列，轻链氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示序列；杂交瘤细胞株1F7 1D8所产生的单克隆抗体可变区重链氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：3所示序列，轻链氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：4。具体序列为：
[0015][0016]本专利技术还提供了上述单克隆抗体在Cry 1F抗虫蛋白定性、定量检测中的应用。
[0017]与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本申请利用转基因玉米种子中纯化得到的抗虫蛋白Cry 1F作为抗原，通过杂交瘤技术制备了2株分泌抗Cry 1F的特异、灵敏单抗的杂交瘤细胞株1D7 1C6和1F7 1D8，所述细胞株分泌单抗腹水纯化后得到的抗体间接ELISA效价分别为1:6140000和1:2050000，所述单抗可以特异识别转基因玉米中Cry 1F蛋白，分泌抗Cry 1F抗虫蛋白的鼠单抗杂交瘤细胞株的构建为转基因作物中该蛋白的检测提供了物质和技术支撑。
[0018]保藏信息
[0019]本专利技术提供的杂交瘤细胞株1D7 1C6和1F7 1D8，已依次于2021年12月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类名称为Cry1Fa单抗杂交瘤细胞株，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。邮编：100101，保藏编号依次为CGMCC No.45008和CGMCC No.45009。
附图说明
[0020]图1是根据本专利技术的杂交瘤细胞株1D7 1C6和1F7 1D8纯化的单克隆抗体的SDS
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PAGE电泳结果图；
[0021]图2是根据本专利技术的杂交瘤细胞株1D7 1C6和1F7 1D8所产生的单克隆抗体滴度；
[0022]图3是根据本专利技术的杂交瘤细胞株1D7 1C6和1F7 1D8所产生的单克隆抗体特异性检测转基因玉米中的Cry 1F Western结果图；
具体实施方式
[0023]下面结合附图，对本专利技术的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本专利技术的保护范围并不受具体实施方式的限制。
[0024]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0025]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径可购得。
[0026]实施例1杂交瘤细胞获得及其单克隆抗体的制备
[0027]1.免疫抗原的制备
[0028]约1kg的转基因玉米种子液氮充分研磨后溶于蛋白提取液中，经高速冷冻离心、变性溶液溶解沉淀、离心分离、离子交换层析和凝胶过滤及复性等多个纯化步骤得到相对较纯的Cry 1F蛋白。
[0029]2.免疫动物
[0030]用Cry 1F蛋白作为抗原免疫8只8周龄的SPF级BALB/c雌性小鼠(购置于湖北省实验动物研究中心，许可证号：SCXK(鄂)2015
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0018)，抗原与等体积完全弗氏佐剂(首免)或不完全弗氏佐剂(加强免疫)混合并进行乳化，充分混合至油包水状态进行皮下多点免疫，2
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3次加强免疫，每次免疫间隔周期2周，之后进行效价检测，高于>1:10000后1周内进行腹腔冲击，直接将免疫剂量的抗原溶于250μL的PBS中，具体免疫次数及免疫剂量如表1所示：
[0031]表1免疫次数及免疫剂量
[0032][0033]免疫示例：一免中，将50ug的抗原溶于PBS，然后与佐剂按体积1:1混合。
[0034]3.细胞融合
[0035]末次冲击3天后，收集阳性对照血，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.杂交瘤细胞株，其特征在于，包括于2021年12月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的生物保藏编号为CGMCC No.45008和CGMCC No.45009的杂交瘤细胞株1D7 1C6和1F7 1D8。2.根据权利要求1所述的杂交瘤细胞株，其特征在于，其制备方法包括以下步骤：a)纯化转基因玉米种子中Cry 1F蛋白；b)免疫动物：将Cry 1F蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠；c)细胞融合：收集免疫BALB/c小鼠的脾细胞并与SP2/0细胞进行融合；d)细胞建株：通过有限稀释法进行亚克隆，亚克隆5
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7天进行ELISA检测，直至筛选出稳定分泌阳性抗体的杂交瘤细胞株进行扩大再培养和保存。3.根据权利要求2所述的杂交瘤细胞株，其特征在于，小鼠的脾细胞与SP2/0细胞的融合比例为1:5
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1:10。4.权利要求1
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3任一项所述的杂交瘤细胞株所产生的单克隆抗体，其特征在于，将杂交瘤细胞株接种到小鼠腹腔中制备腹水，然...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘卫晓，金芜军，苗朝华，宛煜嵩，董美，高进，孟丽霞，赵伟玲，王迪，文婷婷，王占超，陶然，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：