一种猫嵌杯病毒抗原试纸条检测试剂盒制造技术

本发明专利技术提供一种猫嵌杯病毒抗原试纸条检测试剂盒，属于猫嵌杯病毒抗原检测技术领域。为了提供一种准确和有效的检测猫嵌杯病毒抗原的方法。一种检测猫嵌杯病毒的抗体对，所述抗体对是单克隆抗体A

【技术实现步骤摘要】
一种猫嵌杯病毒抗原试纸条检测试剂盒


[0001]本专利技术属于猫嵌杯病毒抗原检测
，具体涉及一种猫嵌杯病毒抗原试纸条检测试剂盒。

技术介绍

[0002]猫嵌杯病毒(Feline Calicivirus，FCV)是一种引起猫科动物口腔与呼吸道疾病的重要病原。FCV感染动物后临床症状主要表现为鼻炎、结膜炎、气管炎、肺炎的口腔上皮细胞的水疱和溃疡。该病也被称为猫传染性鼻结膜炎。FCV常常会与细菌、衣原体、支原体、寄生虫以及其他猫科动物上呼吸道病毒发生混合感染导致死亡率增加。FCV主要通过污染物在自然界传播，在猫之间可直接接触传播，病毒粒子也可通过人手触摸间接传播给易感猫。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的是为了提供一种准确和有效的检测猫嵌杯病毒抗原的方法。
[0004]本专利技术提供一种杂交瘤细胞对，其特征在于，所述杂交瘤细胞对包括第一杂交瘤细胞株A
‑
2株和第二杂交瘤细胞株A
‑
5株。
[0005]本专利技术提供上述杂交瘤细胞对在检测猫嵌杯病毒抗原中的应用。
[0006]本专利技术提供一种检测猫嵌杯病毒的抗体对，所述抗体对是单克隆抗体A
‑
2株和A
‑
5株，所述单克隆抗体A
‑
2是由杂交瘤细胞A
‑
2株分泌获得的；所述单克隆抗体A
‑
5株是由杂交瘤细胞A
‑
5株分泌获得的。
[0007]本专利技术提供上述抗体对在检测猫嵌杯病毒抗原中的应用。
[0008]本专利技术提供一种检测猫嵌杯病毒的试剂盒，所述试剂盒包括上述的抗体对。
[0009]进一步地限定，还包括PVC底板、金标垫、样品垫和吸水垫。
[0010]本专利技术提供上述的试剂盒的制备方法，其特征在于，以PVC背板为支撑物，在其上分别贴有样品垫、金标垫、硝酸纤维膜、吸水垫，其中金标垫采用聚酯膜，经含有1％BSA和1％吐温
‑
20的PBS处理后，将制备好的胶体金标记单克隆抗体A
‑
2金标垫部分，完毕，37℃烘干2h，硝酸纤维膜上包被有两条线：分别为质控线和检测线，其中检测线包被物为单克隆抗体A
‑
5株浓度为1.6mg/mL，质控线包被物为纯化的兔抗鼠抗体浓度为2.1mg/mL，然后用Biodot划膜仪喷涂于硝酸纤维膜上，组装好后大板用切条机切成7
‑
8mm的裸条备用。
[0011]进一步地限定，所述胶体金标记单克隆抗体A
‑
2第一抗体混合物的终浓度为10μg/mL。
[0012]进一步地限定，所述胶体金的制备方法如下：
[0013](1)1％的氯化金水溶液1mL，加入99mL超纯水，配置成0.01％的HAuCl4溶液，加热至沸腾；
[0014](2)加入1.5mL 1％柠檬酸三钠水溶液，继续搅拌加热沸腾2～5min，金黄色的氯金酸水溶液在2min内颜色发生迅速变化，由灰色变成黑色最后变成紫红色，继续煮沸20min得到稳定的胶体金溶液。
[0015]进一步地限定，所述抗体对与标记胶体金混合的方法如下：
[0016](1)用0.2mol/L K2CO3溶液调节胶体金溶液至pH8.0，加入单克隆抗体A
‑
2，混合物的终浓度为10μg/mL；
[0017](2)然后将抗体对的溶液10000rpm 4℃离心15min，弃上清，用复溶液溶解浓缩沉淀，复溶液浓缩比例为125μL/mL；
[0018](3)将浓缩后的胶体金复合物喷涂于胶体金垫内，喷涂量为15μL/cm。
[0019]有益效果：随着当前宠物诊疗业的高速发展，基于免疫反应的猫嵌杯病毒的诊断技术越来越得到重视，而单克隆抗体是诊断抗原的重要试剂，目前已经研发出具备中和作用的单克隆抗体但是缺乏研制猫嵌杯病毒配对单抗的相关报道，而配对的单抗组可以形成检测抗原的三明治结构，是研制夹心法ELISA和抗原胶体金试纸条的关键，为了研制检测抗原的猫嵌杯病毒检测试纸条，拟采用双抗体夹心法，制备形成夹心配对的猫嵌杯病毒单克隆抗体。
附图说明
[0020]图1为FCV VP1纯化产物SDS
‑
PAGE；M：PageRuler Prestained Protein Ladder；
★
：重组FCV
‑
VP1蛋白裂解沉淀；
[0021]图2为FCV
‑
VP1蛋白的免疫反应性；M：PageRuler Prestained Protein Ladder；1：pET
‑
32a阴性对照；2：纯化后重组FCV
‑
VP1蛋白；
[0022]图3为腹水单克隆抗体纯化效果；
[0023]图4为猫嵌杯病毒抗原试纸条示意图。
具体实施方式
[0024]实施例1.猫嵌杯病毒单克隆抗体的制备
[0025]猫嵌杯病毒的培养：FCV
‑
A毒株3000r/min离心15min，取上清加入等量的DMEM营养液，用0.22μm滤器过滤除菌，接种F81单层细胞，置37℃5％CO2培养箱中培养，盲传至第2代出现明显病变，传至第5代时细胞病变稳定，表现为细胞圆缩，呈葡萄串样，最后完全脱落。
[0026]FCV VP1基因扩增与纯化：构建包含VP1蛋白1
‑
204aa的表达质粒；根据GenBank上CDV
‑
PS株H蛋白基因序列(HM165273)设计一对特异性引物。上游引物5
′‑
CCCGAATTCCTCTCTTACCAAGACAAG
‑3′
(SEQ ID NO.1)，下划线为EcoR I酶切位点，下游引物5
′‑
CCGCTCGAGTGATACGGATAGGGGAAT
‑3′
(SEQ ID NO.2)，下划线为Xho I酶切位点。以cDNA为模板扩增后胶回收目的片段。
[0027]将测序正确的重组质粒pET
‑
H204转化至BL21感受态细胞中，挑取阳性菌落接种于氨苄抗性培养基中，37℃，220rpm/min培养8h。随后将菌液按1:100比例接种到新的氨苄抗性培养基中，待OD600nm为0.6时，加入终浓度为0.5mM的IPTG，37℃，220rpm/min培养6h。4℃，5000rpm/min离心10min，弃上清后用PBS溶液重悬沉淀，加入5
×
SDS缓冲液后100℃水浴10min。取制备好的蛋白样品10μl进行SDS
‑
PAGE电泳，电泳完成后对蛋白胶进行考马斯亮蓝染色2h，再用脱色液洗脱背景颜色。100ml诱导后的菌体10000rpm离心3min，用PBS溶液洗涤3次后用平衡缓冲液(Tris
‑
HCL,pH＝7.9，咪唑，氯化钠)重悬菌体，超声破碎仪破碎后弃上清。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种杂交瘤细胞对，其特征在于，所述杂交瘤细胞对包括第一杂交瘤细胞株A
‑
2株和第二杂交瘤细胞株A
‑
5株。2.权利要求1所述杂交瘤细胞对在检测猫嵌杯病毒抗原中的应用。3.一种检测猫嵌杯病毒的抗体对，其特征在于，所述抗体对是单克隆抗体A
‑
2株和A
‑
5株，所述单克隆抗体A
‑
2是由杂交瘤细胞A
‑
2株分泌获得的；所述单克隆抗体A
‑
5株是由杂交瘤细胞A
‑
5株分泌获得的。4.权利要求3所述抗体对在检测猫嵌杯病毒抗原中的应用。5.一种检测猫嵌杯病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求3所述的抗体对。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，还包括PVC底板、金标垫、样品垫和吸水垫。7.权利要求6所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，以PVC背板为支撑物，在其上分别贴有样品垫、金标垫、硝酸纤维膜、吸水垫，其中金标垫采用聚酯膜，经含有1％BSA和1％吐温
‑
20的PBS处理后，将制备好的胶体金标记单克隆抗体A
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2金标垫部分，完毕，37℃烘干2h，硝酸纤维膜上包被有两条线：分别为质控线和检测线，其中检测线包被物...

【专利技术属性】
技术研发人员：程悦宁，王振军，罗国良，冯二凯，易立，
申请(专利权)人：中国农业科学院特产研究所，
类型：发明
国别省市：