分泌抗李属坏死环斑病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用制造技术

本发明专利技术公开了一种分泌抗李属坏死环斑病毒(Prunus necrotic ring

【技术实现步骤摘要】
分泌抗李属坏死环斑病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种分泌抗李属坏死环斑病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗的应用。

技术介绍

[0002]李属坏死环斑病毒(Prunus necrotic ring
‑
spot virus，PNRSV)属于雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)等轴不稳环斑病毒属(Ilarvirus)。PNRSV的粒体形态为等轴对称多面体，直径约为22～23nm，有三种大小的粒子。其病毒基因组由3条正义单链RNA组成，RNA1和RNA2分别编码复制酶蛋白P1和P2，RNA3编码运动蛋白和外壳蛋白。
[0003]PNRSV是一种在世界范围内广泛发生的病毒病原物，可危害多种植物，自然寄主主要有樱桃、桃、杏、李、苹果、啤酒花和月季，其它寄主包括烟草、西瓜、甜瓜、南瓜、西葫芦、菜豆、豇豆、豌豆、莴苣、向日葵等。PNRSV最早发现于李和桃树上，主要分布在欧洲、美洲、大洋洲等温带地区。PNRSV在国内的初次报道是在陕西省的西安被自然侵染的秋海棠上。随后又有多个地区相继报道了PNRSV的发生。
[0004]被PNRSV感染的桃树有些在春季幼叶表现出褪绿环斑、坏死斑，但在夏季症状不易识别，有些在春季也无明显症状，有些表现为果实缝合线处有小裂口。PNRSV可引起植株表现出多种不同的症状，其症状与病毒株系、寄主品种的感病性以及环境条件有关。常见症状包括碎叶、带状叶、线纹、坏死环斑、粗花叶和叶片脱落，甚至全株枯死。其还可与苹果花叶病毒、苹果褪绿病斑病毒混合侵染果树。
[0005]迄今为止，植物病毒病缺乏有效的防治药剂，而简单快速、灵敏特异、准确实用的检测技术是病毒病监测、预警和开展绿色防控的关键。为了强化我国PNRSV的检验检疫技术，急需建立检测PNRSV简单快速、经济有效、高通量的实用检测技术。与常规的指示植物接种、电镜观察、分子检测等方法相比，血清学方法具有简单、经济、易操作、可高通量检测等优点，是植物病毒检测和调查最实用的方法。但血清学的方法的建立依赖于特异性高质量的病毒抗体。本专利技术以原核表达的PNRSV衣壳蛋白(coat protein,CP)作为抗原，通过杂交瘤技术制备了1株分泌PNRSV特异性单抗的杂交瘤细胞株，以分泌的单抗为检测抗体建立检测PNRSV的血清学方法及试剂盒，从而为我国PNRSV的口岸检验检疫、流行病学的调查、病毒基因组功能分析、抗性育种、科学防范建立等提供试剂和技术支持。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种分泌抗李属坏死环斑病毒单抗的杂交瘤细胞株及其单抗应用。
[0007]本专利技术具体采用的技术方案如下：
[0008]第一方面，本专利技术提供了一种分泌抗李属坏死环斑病毒单抗的杂交瘤细胞株9E1，它能分泌抗李属坏死环斑病毒的特异性单抗，杂交瘤细胞株9E1于2022年11月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.45329。
[0009]第二方面，本专利技术提供了一种上述第一方面所述的杂交瘤细胞分泌的抗李属坏死环斑病毒单克隆抗体。该单抗腹水间接ELISA效价达10
‑7，抗体类型及亚类为IgG2b、κ轻链，与李属坏死环斑病毒30kDa左右的外壳蛋白有特异性免疫反应，利用该单抗建立ACP
‑
ELISA和dot
‑
ELISA方法检测感染PNRSV病叶组织粗提液的灵敏度分别达到1:10240和1:1280倍稀释(w/v,g/mL)。
[0010]所述的抗李属坏死环斑病毒单克隆抗体能与李属坏死环斑病毒有特异性免疫反应，而不与李痘病毒、黄瓜绿斑驳花叶病毒、苹果茎沟病毒、苹果坏死花叶病毒和健康植物组织发生免疫反应。
[0011]第三方面，本专利技术提供了一种如上述第二方面所述的抗李属坏死环斑病毒单克隆抗体在该病毒检测上的应用，它是以单抗为检测抗体建立的各种免疫学检测方法和检测试剂盒。
[0012]本专利技术与现有技术相比具有的有益效果：1)提供的杂交瘤细胞株分泌大量抗PNRSV特异性单克隆抗体，以该单抗为检测抗体建立的ACP
‑
ELISA、dot
‑
ELISA和Tissue print
‑
ELISA血清学检测方法及其检测试剂盒能快递、特异、灵敏、准确地检测PNRSV；2)利用本专利技术所制备的单克隆抗体检测PNRSV病毒，对操作人员的技术要求低，不需要昂贵的电子显微镜、PCR仪等设备；3)利用本专利技术所制备的单克隆抗体可有效地用于田间PNRSV的检测诊断及口岸检验检疫，也可用于该病毒病的流行病学调查、病毒基因组功能分析、抗性育种、科学防控等方面。
附图说明
[0013]图1PNRSV CP基因的RT
‑
PCR克隆(A)及其重组蛋白的表达纯化(B)结果；
[0014](1B)M：蛋白Marker；1
‑
3：100mM咪唑、200mM咪唑、50mM咪唑洗脱的重组蛋白。
[0015]图2Western blot实验分析9E1单克隆抗体的特异性结果
[0016]图3dot
‑
ELISA方法的特异性(A)和灵敏度(B)分析结果
[0017]图4Tissue print
‑
ELISA方法的特异性分析结果
[0018]生物保藏
[0019]分泌抗李属坏死环斑病毒单抗杂交瘤细胞株9E1于2022年11月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏号为CGMCC No.45329。
具体实施方式
[0020]分泌抗李属坏死环斑病毒单抗杂交瘤细胞株9E1于2022年11月7日保藏于中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.45329，它能分泌抗李属坏死环斑病毒的单抗。
[0021]一种上述杂交瘤细胞株9E1分泌的抗李属坏死环斑病毒单克隆抗体，该单抗腹水间接ELISA效价达10
‑7，抗体类型及亚类为IgG2b、κ轻链，与李属坏死环斑病毒30kDa左右的外壳蛋白有特异性免疫反应，利用该单抗建立ACP
‑
ELISA和dot
‑
ELISA方法检测感染PNRSV病叶组织粗提液的灵敏度分别达到1:10240和1:1280倍稀释(w/v,g/mL)。
[0022]上述抗李属坏死环斑病毒单克隆抗体能与李属坏死环斑病毒有特异性免疫反应，
而不与李痘病毒、黄瓜绿斑驳花叶病毒、苹果茎沟病毒、苹果坏死花叶病毒和健康植物组织发生免疫反应。
[0023]上述抗李属坏死环斑病毒单克隆抗体在该病毒检测上的应用是以单抗为检测抗体建立的各种免疫学检测方法和免疫学检测试剂盒。
[0024]本专利技术提供的杂交瘤细胞株能大量分泌抗李属坏死环斑病毒单抗，且本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种分泌抗李属坏死环斑病毒单抗杂交瘤细胞株9E1，其特征在于能分泌抗李属坏死环斑病毒单抗，所述的杂交瘤细胞株9E1于2022年11月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.45329。2.一种如权利要求1所述的杂交瘤细胞株9E1分泌的抗李属坏死环斑病毒单抗。3.如权利要求2所述的抗李属坏死环斑病毒单抗，其特征在于该单抗腹水间接ELISA效价达10
‑7，抗体类型及亚类为IgG2b、κ轻链，该单克隆抗体与李属坏死环斑病毒30kDa左右的外壳蛋白有特异性免疫反应，利用该单抗建立ACP
‑<...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴建祥，戚朵，周雪平，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：