抗猪δ冠状病毒NS7和NS7a蛋白的杂交瘤细胞株、单克隆抗体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种抗猪δ冠状病毒NS7和NS7a蛋白杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株命名为杂交瘤细胞株PDCoV

【技术实现步骤摘要】
抗猪
δ
冠状病毒NS7和NS7a蛋白的杂交瘤细胞株、单克隆抗体及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及抗猪δ冠状病毒NS7和NS7a蛋白的杂交瘤细胞株、单克隆抗体及其应用。

技术介绍

[0002]猪δ冠状病毒(Porcine deltacoronavirus，PDCoV)是一种新发的猪冠状病毒主要对新生仔猪有重要威胁，感染的新生仔猪具有较高的死亡率，临床症状与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、传染性胃肠炎病毒(TGEV)相似，主要表现为呕吐、急性水样腹泻、脱水甚至死亡。生长猪、成年猪及生产母猪发病轻微，可不治而愈。近年来全球各地养猪地区均报道了该病的发生，给全球养猪业造成了巨大的经济损失。2021年有报道称研究人员在三名患有急性发热疾病的海地儿童血浆样本中检测到了PDCoV，这提示了PDCoV有跨种传播感染人类的风险，因此我们必须对此病毒加以重视。
[0003]猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)属于δ冠状病毒是一种新发现的猪肠道致病性冠状病毒，目前也是δ冠状病毒属的唯一成员。其全长基因组大小约为25.4kb，也是冠状病毒基因组中最小的冠状病毒。其基因组包括非编码区与编码区，其中非编码区为基因组的5端与3端的5～UTR、3～UTR，以及5末端与3末端的一个帽子结构和一个poly(A)结构。这些区域虽然不编码蛋白，但是对于该病毒的复制与转录具有重要的调控作用。病毒编码区为开放阅读框(open reading frame)ORF1a和ORF1b、棘突蛋白S、包膜蛋白E、膜蛋白M、辅助蛋白NS6、核衣壳蛋白N、以及位于N蛋白内部的两个辅助蛋白NS7和NS7a。PDCoV编码的三种辅助蛋白(NS6、NS7、NS7a)不参与病毒粒子的组成但是在病毒复制过程中承担着重要角色。NS7蛋白位于PDCoV N蛋白的内部，两者具有不同的氨基酸序列，在NS7蛋白的内部还有一个辅助蛋白NS7a，目前已知NS7a具有拮抗I型干扰素产生的功能，但是对于NS7蛋白功能的报道甚少。
[0004]单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。通过单克隆抗体技术来获取杂交瘤细胞株，该技术已经应用到了兽医领域多个动物病毒的研究之中，如非洲猪瘟病毒、口蹄疫病毒、流感病毒等。因此为了进一步研究NS7与NS7a蛋白的功能，以及两者之间的关系，我们有必要制备特异性强的单克隆抗体。

技术实现思路

[0005]专利技术目的：本专利技术所要解决的技术问题是提供了一种抗猪δ冠状病毒NS7和NS7a蛋白杂交瘤细胞株。
[0006]本专利技术还要解决的技术问题是提供了一种单克隆抗体，所述单克隆抗体由所述的杂交瘤细胞株分泌产生。
[0007]本专利技术还要解决的技术问题是提供了一种核酸分子，其编码所述的单克隆抗体。
[0008]本专利技术还要解决的技术问题是提供了所述的单克隆抗体、所述的核酸分子在制备检测或诊断猪δ冠状病毒的试剂、试纸条或试剂盒中的应用。
[0009]本专利技术最后要解决的技术问题是提供了一种猪δ冠状病毒的检测试剂盒。
[0010]技术方案：为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种抗猪δ冠状病毒NS7和NS7a蛋白杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株命名为杂交瘤细胞株PDCoV
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NS7
‑
08A，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉
·
武汉大学，保藏日期为2022年8月18日，保藏编号为CCTCC NO：C2022271。
[0011]本专利技术还提供了一种抗猪δ冠状病毒NS7和NS7a蛋白杂交瘤细胞株的制备方法，包括以下步骤：原核表达的重组猪δ冠状病毒NS7蛋白与弗氏佐剂混合后注射BALB/C小鼠，并对IFA检测结果阳性的小鼠进行加强免疫；
[0012]将加强免疫后的小鼠采集脾B淋巴细胞，并与杂交瘤细胞进行融合，挑选阳性克隆后进行亚克隆得到抗猪δ冠状病毒NS7和NS7a蛋白杂交瘤细胞株。
[0013]本专利技术还提供了一种抗猪δ冠状病毒NS7和NS7a蛋白杂交瘤细胞株的制备方法，该方法具体包括以下步骤：
[0014](1)原核表达的重组猪δ冠状病毒NS7蛋白与弗氏佐剂1∶1混合后注射BALB/C小鼠，100ug/只，三次免疫后对IFA检测结果阳性的小鼠进行加强免疫，剂量50～100ug/只。
[0015](2)IFA方法测定血清抗体稀释度在1∶103的小鼠采集脾B淋巴细胞与杂交瘤细胞进行融合，挑选阳性克隆后进行亚克隆得到抗猪δ冠状病毒NS7和NS7a蛋白杂交瘤细胞株。
[0016]本
技术实现思路
还包括一种单克隆抗体，所述单克隆抗体由所述的杂交瘤细胞株分泌产生。
[0017]其中，所述单克隆抗体针对的抗原表位位于NS7蛋白第111～117位氨基酸，其多肽序列为
111
PSTLEED
117
。
[0018]其中，所述单克隆抗体的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1～3所示；轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4～6所示。
[0019]其中，所述单克隆抗体的重链可变区与轻链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示。
[0020]本
技术实现思路
还包括一种核酸分子，其编码所述的单克隆抗体。
[0021]其中，所述核酸分子编码单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示，所述核酸分子编码抗体的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示。
[0022]本
技术实现思路
还包括所述的单克隆抗体、所述的核酸分子在制备检测或诊断猪δ冠状病毒的试剂、试纸条或试剂盒中的应用。
[0023]本
技术实现思路
还包括一种猪δ冠状病毒的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括所述的单克隆抗体。
[0024]其中，所述检测试剂盒还包括阳性对照和阴性对照。
[0025]本
技术实现思路
还包括一种非诊断用途的检测猪δ冠状病毒的方法，使用上述单克隆抗体或上述试剂、试纸条或试剂盒。
[0026]有益效果：与现有技术相比，本专利技术具有以下显著优势：
[0027]1、本专利技术公开的杂交瘤细胞株PDCoV
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NS7
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08A，其所分泌的单克隆抗体与猪δ冠状病毒NS7和NS7a蛋白具有良好的反应特异性。
[0028]2、本专利技术首次明确了PDCoV的一个线性B细胞表位，表明分泌单克隆抗体的杂交瘤
细胞株可以识别大多数PDCoV毒株，为PDCoV新型诊断试剂的研究工作提供了有力的免疫学工具。
附图说明
[0029]图1是由杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体与PDCoV感染细胞的间接免疫荧光图；
[0030]图2是由杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体的Western blot结果；
[0031]图3是由杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体与PDCoV感本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗猪δ冠状病毒NS7和NS7a蛋白杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株命名为杂交瘤细胞株PDCoV
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NS7
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08A，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉
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武汉大学，保藏日期为2022年8月18日，保藏编号为CCTCC NO：C2022271。2.一种抗猪δ冠状病毒NS7和NS7a蛋白的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌产生。3.根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体针对的抗原表位位于NS7蛋白第111~117位氨基酸，其多肽序列为
111
PSTLEED
117
。4.根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1~3所示；轻...

【专利技术属性】
技术研发人员：牟春晓，谢思汉，陈振海，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：