一种糖链标志物检测ALT正常的慢性乙型肝炎患者显著肝纤维化的检测试剂、使用方法及应用技术

本发明专利技术提供了一种糖链标志物检测ALT正常的慢性乙型肝炎患者显著肝纤维化的检测试剂、使用方法及应用，检测试剂由以下试剂混合而成，试剂A：浓度5

【技术实现步骤摘要】
一种糖链标志物检测ALT正常的慢性乙型肝炎患者显著肝纤维化的检测试剂、使用方法及应用


[0001]本专利技术属于谷丙转氨酶(ALT)正常的慢性乙型肝炎患者肝纤维化尿液生物标志物研究方法的建立，尤其涉及一种糖链标志物检测ALT正常的慢性乙型肝炎患者肝纤维化的检测方法及应用，属于生物医药


技术介绍

[0002]慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染是慢性肝病的主要原因之一，相当数量的慢性乙型肝炎患者将发展为肝纤维化，最终发展为肝衰竭或肝细胞癌。临床上，慢性乙型肝炎患者的抗病毒治疗研究为肝纤维化的消退提供了令人信服的证据。因此，如果慢性乙型肝炎肝纤维化患者能够得到及时有效的治疗，就有可能实现肝纤维化的全面消退。
[0003]在慢性乙型肝炎患者中，抗病毒治疗的开始是基于肝脏组织学进展、丙氨酸氨基转移酶(ALT)和HBV DNA水平，慢性乙型肝炎患者指南建议对有显著的肝纤维化、ALT水平正常(<40IU/L)的慢性乙型肝炎患者进行抗病毒治疗。因此，如果有标志物可以区分显著的肝纤维化(>F3 Ishak评分)与早期和无肝纤维化(<F3，Ishak得分)，这将有助于决定ALT水平正常的慢性乙型肝炎患者是否需要接受治疗。然而，肝活检仍然是肝纤维化分期的金标准，作为一种具有一定局限性的侵入性手段，不能在临床上常规进行。此外，评估肝纤维化的主要无创诊断工具是基于影像学和血清学参数的生物标志物，但是现有方法均存在一定的局限性；如超声、CT和MRI是传统的成像方法，在临床实践中广泛使用。然而这些方法定性地判断肝纤维化的程度，并且评估标准具有高度主观性，无法对肝纤维化程度进行准确地分期。瞬态弹性成像(LSM)已成为一种能够无创评估肝脏硬度的技术(12)，但由于需要昂贵的设备和训练有素的操作员，以及众多影响测量的因素，可能会限制其临床应用。一些血清生物标志物，包括基于四个因素的纤维化指数(FlB
‑
4)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)与血小板比率指数(APRI)，已被构建用于临床应用，但其诊断效率有待进一步研究。因此，迫切需要一种新型无创标记物来评估ALT水平正常的慢性乙型肝炎患者是否存在显著肝纤维化。
[0004]糖基化是蛋白质的一种重要的翻译后修饰。人体内N
‑
糖蛋白主要由肝脏和B淋巴细胞合成，N
‑
糖蛋白的聚糖结构与数量的异常往往可以反映肝脏病变。研究表明，聚糖的结构和功能在不同肝病状态下发生显著变化。因此，糖链标志物对ALT正常水平的慢性乙型肝炎患者显著肝纤维化进行辅助诊断具有重要的临床价值。

技术实现思路

[0005]针对目前临床上使用的ALT正常的慢性乙型肝炎患者肝纤维化检测中存在的问题，本专利技术提供了一种用于指导ALT正常的慢性乙型肝炎患者显著肝纤维化状态评估的糖链标志物评分及其研究方法，基于测定ALT正常的慢性乙型肝炎患者尿液中糖链，根据患者纤维化分期建立糖链标志物评分判断ALT正常的慢性乙型肝炎患者显著肝纤维化状态。
[0006]本专利技术采用的技术方案如下：
[0007]一种糖链标志物检测ALT正常的慢性乙型肝炎患者显著肝纤维化的检测试剂，其特征在于，由以下试剂组成：
[0008]试剂A：浓度5
‑
10mM的碳酸氢铵溶液中加入质量浓度1
‑
10％的SDS配制而成；
[0009]试剂B：质量浓度1
‑
10％的NP40中加入2
‑
10单位/μL的糖苷外切酶配制而成；
[0010]试剂C：由浓度100mM、pH 5
‑
7的NH4AC加入2
‑
10单位/μL的内切酶配制而成；
[0011]试剂D：纯水；
[0012]试剂E：浓度5
‑
20mM的荧光标记物与含浓度1
‑
5M有机还原剂的DMSO溶液混合而成。
[0013]优选的，所述荧光标记物为8
‑
氨基芘
‑
1,3,6
‑
三磺酸三钠盐。
[0014]优选的，所述有机还原剂为氢化钠。
[0015]一种糖链标志物检测ALT正常的慢性乙型肝炎患者显著肝纤维化的检测试剂的使用方法，包括以下步骤：
[0016]步骤1用专一性的N
‑
糖苷键水解酶制备自由寡糖链：在5μL尿液中加入3μL试剂A，95℃下加热5分钟变性，冷却到常温，然后加入3μL试剂B和4μL试剂C，37℃反应4小时，最后加入80μL试剂D；
[0017]步骤2荧光标记自由寡糖链：取10μL步骤1得到的液体，70℃下干燥30分钟，再加入3μL试剂E，90℃放置2小时，然后加入80μL试剂D终止反应；
[0018]步骤3分离分析荧光标记的糖链：取8μL步骤2得到的液体，用测序仪进行糖链的分离；
[0019]步骤4对步骤3检测得到的糖链图谱中的6种糖链NGA2F、NGA2FB、NG1A2F、NA2、NA3和NA4的结果进行量化计算，得到模型LR
‑
A。
[0020]一种组合物在制备糖链标志物检测ALT正常的慢性乙型肝炎患者显著肝纤维化的检测试剂中的应用，所述组合物由尿液中的N糖链NGA2F、NGA2FB、NG1A2F、NA2、NA3和NA4组成，组合物通过显著肝纤维化糖链标志物模型LR
‑
A的值来判断ALT正常的慢性乙型肝炎患者显著肝纤维化状态。
[0021]优选的，所述LR
‑
A＝3.2
×
NGA2F+2.6
×
NGA2FB+5.8
×
NG1A2F
‑
1.7
×
NA2
[0022]‑
1.95
×
NA3
‑
2.4
×
NA4+7.79。
[0023]优选的，所述LR
‑
A≥0.5时为显著肝纤维化状态，LR
‑
A<0.5时为早期或无纤维化状态。
[0024]本专利技术通过收集入组对象的尿液进行糖链生物标志物的检测，以便确定所述生物标志物的量，通过多元逻辑回归法，在ALT正常的慢性乙型肝炎显著纤维化和早期或无纤维化患者之间，鉴定显著纤维化相关的特异性的糖链标志物。具体包括：
[0025](1)收集入组对象的尿液，进行糖链的检测；
[0026](2)在训练集，通过多元逻辑回归法，在ALT正常的慢性乙型肝炎显著纤维化和早期或无纤维化患者之间，鉴定显著纤维化相关的特异性的糖链标志物，建立相关的模型；
[0027](3)在验证集，计算验证集患者应用该模型的敏感度、特异度和准确率；
[0028](4)糖链标志物LR
‑
A分别与LSM、APRI和FIB
‑
4对比，表明糖链标志物优于现有检测手段本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种糖链标志物检测ALT正常的慢性乙型肝炎患者显著肝纤维化的检测试剂，其特征在于，由以下试剂组成：试剂A：浓度5
‑
10mM的碳酸氢铵溶液中加入质量浓度1
‑
10％的SDS配制而成；试剂B：质量浓度1
‑
10％的NP40中加入2
‑
10单位/μL的糖苷外切酶配制而成；试剂C：由浓度100mM、pH 5
‑
7的NH4AC加入2
‑
10单位/μL的内切酶配制而成；试剂D：纯水；试剂E：浓度5
‑
20mM的荧光标记物与含浓度1
‑
5M有机还原剂的DMSO溶液混合而成。2.根据权利要求1所述的糖链标志物检测ALT正常的慢性乙型肝炎患者显著肝纤维化的检测试剂，其特征在于，所述荧光标记物为8
‑
氨基芘
‑
1,3,6
‑
三磺酸三钠盐。3.根据权利要求1所述的糖链标志物检测ALT正常的慢性乙型肝炎患者显著肝纤维化的检测试剂，其特征在于，所述有机还原剂为氢化钠。4.根据权利要求1
‑
3任一所述的糖链标志物检测ALT正常的慢性乙型肝炎患者显著肝纤维化的检测试剂的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1用专一性的N
‑
糖苷键水解酶制备自由寡糖链：在5μL尿液中加入3μL试剂A，95℃下加热5分钟变性，冷却到常温，然后加入3μL试剂B和4μL试剂C，37℃反应4小时，最后加入80μL试剂D；步骤2荧光标记自由寡糖链：取10μL步骤1得到的液体，70℃下干...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈翠英，王林，庄辉，张军利，徐蕾，
申请(专利权)人：先思达南京生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：