巨型艾美耳球虫子孢子可溶性蛋白中共同免疫原性蛋白的筛选与鉴定方法技术

本发明专利技术公开了一种巨型艾美耳球虫子孢子可溶性蛋白中共同免疫原性蛋白的筛选方法，包括以下步骤：S1.双向电泳；S2.蛋白质免疫印迹实验。本发明专利技术以巨型艾美耳球虫子孢子可溶性蛋白为研究对象，采用免疫蛋白组学方法，系统筛选其中能够被多种艾美耳球虫高免血清所共同识别的巨型艾美耳球虫子孢子可溶性蛋白；筛选出的共同免疫原性蛋白经蛋白质谱鉴定，并经MASCOT在线工具检索得到相应蛋白信息。MASCOT在线工具检索得到相应蛋白信息。MASCOT在线工具检索得到相应蛋白信息。

【技术实现步骤摘要】
巨型艾美耳球虫子孢子可溶性蛋白中共同免疫原性蛋白的筛选与鉴定方法


[0001]本专利技术涉及免疫蛋白组学
，尤其涉及巨型艾美耳球虫子孢子可溶性蛋白中共同免疫原性蛋白的筛选与鉴定方法。

技术介绍

[0002]鸡球虫病是一种对养鸡行业危害极大的肠道寄生虫病，每年能在全球造成数十亿美元的经济损失。
[0003]目前全世界鸡球虫有9种，在我国发现的有柔嫩艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、早熟艾美耳球虫、布氏艾美耳球虫、和缓艾美耳球虫共7种，其中以柔嫩、毒害、巨型、堆型四种艾美耳球虫造成的危害最大，鸡感染球虫后通常会导致肠道出血、饲料转化率降低、体重下降，严重的还会导致死亡。
[0004]鸡球虫对不同生长阶段的鸡均有感染力，但对雏鸡的危害最大，能导致雏鸡的大量死亡，因此，如何能够有效的防治鸡球虫病在养殖行业成为了一个棘手的问题，目前鸡球虫病防控仍以添加化学药物为主，但不可避免会导致耐药性的产生和药物残留的危害，并且越来越多的消费者担心食物中药物残留的风险。
[0005]使用减毒活疫苗进行免疫可以有效的控制鸡球虫病，但是由于球虫不能在宿主体外进行繁殖，疫苗的生产成本高并且有毒力返强的风险，上述不足之处在很大程度上限制了弱毒活疫苗的使用，因此，研发鸡球虫基因工程亚单位疫苗成为当前鸡球虫疫苗研发的重要方向，然而，鸡所生存与活动的环境中往往会同时存在多种不同类型的鸡球虫，进而对鸡造成混合感染，抗单一种类球虫的基因工程亚单位疫苗难以满足养殖户需求，因此，研发具有交叉免疫保护力的鸡球虫疫苗更是有着极为重要的前景。

技术实现思路

[0006]针对上述不足，本专利技术的目的在于提供巨型艾美耳球虫子孢子可溶性蛋白中共同免疫原性蛋白筛选方法，以巨型艾美耳球虫子孢子可溶性蛋白为研究对象，采用免疫蛋白组学方法，系统筛选其中能够被多种艾美耳球虫高免血清所共同识别的巨型艾美耳球虫子孢子可溶性蛋白；筛选出的共同免疫原性蛋白经蛋白质谱鉴定，并经MASCOT在线工具检索得到相应蛋白信息。
[0007]本专利技术为达到上述目的所采用的技术方案是：一种巨型艾美耳球虫子孢子可溶性蛋白中共同免疫原性蛋白的筛选方法，包括以下步骤：
[0008]S1.双向电泳：将巨型艾美耳球虫子孢子中可溶性蛋白通过等电聚焦进行第一向分离，再通过凝胶电泳进行第二相分离，使得巨型艾美耳球虫子孢子中可溶性蛋白依次按等电点和分子量进行分离，实现巨型艾美耳球虫子孢子中可溶性蛋白的双向分离，获得蛋白分离凝胶；
[0009]S2.蛋白质免疫印迹实验：将经步骤S1分离后的巨型艾美耳球虫子孢子可溶性蛋
白分别与四种鸡艾美尔球虫的高免鸡血清进行蛋白免疫印迹实验，筛选出能够分别被四种高免鸡血清识别的共同免疫原性蛋白。
[0010]作为本专利技术的进一步改进，所述双向电泳包括以下步骤：
[0011]1)第一向等电聚焦：先将纯化后的巨型艾美耳球虫子孢子可溶性蛋白沉淀在IPG水化液中重新溶解；在室温下，先孵育至少1小时，再以15，000rpm离心15分钟，以除去不溶解的物质，获得蛋白质缓冲液；最后，450μL含200μg蛋白质的缓冲液加载到长度为24cm，且pH值为3
‑
10的非线性固相pH梯度胶条上，将加载有蛋白质缓冲液的固相pH梯度胶条按以下四步进行第一向等电聚焦：
[0012]①0‑
50V，12小时；
[0013]②
50
‑
8000V，4小时；
[0014]③
8000
‑
10000V，4小时；
[0015]④
10000V，4小时；
[0016]2)第二向聚丙烯酰胺凝胶电泳：室温下，将完成第一向等电聚焦处理的固相pH梯度胶条先在平衡缓冲液Ⅰ中平衡处理后，再在平衡缓冲液II中进行平衡处理，然后使用EttanDALT 12系统在12.5％w/vSDS
‑
PAGE凝胶上进行第二向凝胶电泳，获得蛋白分离凝胶。
[0017]作为本专利技术的进一步改进，所述IPG水化液包括下述组份：8mol/Lurea、2％w/vCHAPS、50mmol/Ldithiothreitol、0.2％v/vBio
‑
Lyte 3
–
10ampholytes、及0.001％w/v bromophenol blue；所述平衡缓冲液Ⅰ包括下述组份：50mmol/LTris
‑
HCl、6mol/Lurea、2％w/v SDS、30％v/v甘油、及1％w/v DTT，其用量为10mL，平衡时间为15min；
[0018]所述平衡缓冲液II包括下述组分：375mmol/LTris
–
HCl、6mol/Lurea、2.5％w/viodoracetamide、及2％w/v SDS，其用量为6ml，平衡时间为15min；
[0019]作为本专利技术的进一步改进，所述Tris
–
HCl的pH为8.8。
[0020]作为本专利技术的进一步改进，所述蛋白质免疫印迹实验包括以下步骤：
[0021]①
转膜：将经步骤S1分离后的巨型艾美耳球虫子孢子可溶性蛋白，从蛋白分离凝胶上转移到PVDF膜，转膜时间为2小时，电流/面积为0.80mA/cm2；
[0022]②
封闭：转膜后，在室温下转移至含5％w/v脱脂牛奶、及0.05％v/vTween
‑
20的PBST中封闭2小时；
[0023]③
一抗孵育：将高免鸡血清与PBS按体积比为1:100进行稀释后与膜在4℃下过夜孵育；
[0024]④
二抗孵育：一抗孵育后的膜使用PBST清洗后，使用与HRP结合的山羊抗鸡IgG与膜在37℃条件下孵育2小时，再次用PBST将膜彻底清洗1小时；
[0025]⑤
ECL显影：将ECL显影液A液与B液等体积加入避光的EP管中，混合均匀；在遮光环境中，把膜放入曝光机中，将制备好的ECL工作液均匀滴加至PVDF膜上，并且适当地正反面翻转PVDF膜，使其与ECL工作液均匀接触，并且将空气排尽，防止气泡的产生；调设好设备参数，进行曝光，观察曝光结果，使用Bio
‑
rad凝胶成像系统拍照，获得蛋白质斑点图。
[0026]作为本专利技术的进一步改进，所述PBST含有5％w/v脱脂乳、及0.05％v/vTween
‑
20。
[0027]作为本专利技术的进一步改进，所述4种高免鸡血清为感染了巨型艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、柔嫩艾美耳球虫、及毒害艾美耳球虫的高免鸡血清。
[0028]作为本专利技术的进一步改进，在进行步骤S1后，还包括以下步骤：
[0029]S1
‑
1.凝胶硝酸银染色：用于对分离后的巨型艾美耳球虫子孢子可溶性蛋白进行染色，获得染色的电泳图谱。
[0030]作为本专利技术的进一步改进，所述凝胶硝酸银染本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.巨型艾美耳球虫子孢子可溶性蛋白中共同免疫原性蛋白的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.双向电泳：将巨型艾美耳球虫子孢子中可溶性蛋白通过等电聚焦进行第一向分离，再通过凝胶电泳进行第二相分离，使得巨型艾美耳球虫子孢子中可溶性蛋白依次按等电点和分子量进行分离，从而实现巨型艾美耳球虫子孢子中可溶性蛋白的双向分离，获得蛋白分离凝胶；S2.蛋白质免疫印迹实验：将经步骤S1分离后的巨型艾美耳球虫子孢子可溶性蛋白，分别与四种鸡艾美尔球虫的高免鸡血清进行蛋白免疫印迹实验，筛选出能够分别被四种高免鸡血清识别的共同免疫原性蛋白。2.根据权利要求1所述的巨型艾美耳球虫子孢子可溶性蛋白中共同免疫原性蛋白的筛选方法，其特征在于，所述双向电泳包括以下步骤：1)第一向等电聚焦：先将纯化后的巨型艾美耳球虫子孢子可溶性蛋白沉淀在IPG水化液中重新溶解；在室温下，先孵育至少1小时，再以15，000rpm离心15分钟，以除去不溶解的物质，获得蛋白质缓冲液；最后，取450μL含200μg蛋白质的缓冲液加载到长度为24cm，且pH值为3
‑
10的非线性固相pH梯度胶条上泡胀，上面覆盖矿物油，将加载有蛋白质缓冲液的固相pH梯度胶条按以下四步进行第一向等电聚焦：
①0‑
50V，12小时；
②
50
‑
8000V，4小时；
③
8000
‑
10000V，4小时；
④
10000V，4小时；2)第二向聚丙烯酰胺凝胶电泳：室温下，将完成第一向等电聚焦处理的固相pH梯度胶条先在平衡缓冲液Ⅰ中平衡处理后，再在平衡缓冲液II中进行平衡处理，然后使用EttanDALT 12系统在12.5％w/vSDS
‑
PAGE凝胶上进行第二向凝胶电泳，获得蛋白分离凝胶。3.根据权利要求1所述的巨型艾美耳球虫子孢子可溶性蛋白中共同免疫原性蛋白的筛选方法，其特征在于，所述IPG水化液包括下述组份：8mol/Lurea、2％w/vCHAPS、50mmol/L dithiothreitol、0.2％v/v Bio
‑
Lyte3
–
10ampholytes、及0.001％w/vbromophenolblue；所述平衡缓冲液Ⅰ包括下述组份：50mmol/LTris
‑
HCl、6mol/L urea、2％w/v SDS、30％v/v甘油、及1％w/v DTT，其用量为10mL，平衡时间为15min；所述平衡缓冲液II包括下述组分：375mmol/LTris
–
HCl、6mol/Lurea、2.5％w/v iodoracetamide、及2％w/v SDS，其用量为6ml，平衡时间为15min；所述Tris
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HCl的pH为8.8。4.根据权利要求1所述的巨型艾美耳球虫子孢子可溶性蛋白中共同免疫原性蛋白的筛选方法，其特征在于，所述蛋白质免疫印迹实验包括以下步骤：
①
转膜：将经步骤S1分离后的巨型艾美耳球虫子孢子可溶性蛋白，从蛋白分离凝胶上转移到PVDF膜，转膜时间为2小时，电流/面积为0.80...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘立恒，龚海伟，王义华，郭小权，王小莺，刘宝生，陈炜毅，刘意，
申请(专利权)人：江西农业大学，
类型：发明
国别省市：