肿瘤浸润淋巴细胞的培养方法技术

本发明专利技术涉及肿瘤浸润淋巴细胞的培养方法以及所涉培养基。本发明专利技术提供肿瘤浸润淋巴细胞培养基，包括细胞因子、刺激型抗体和细胞培养成分，其中，所述细胞因子包括IL

【技术实现步骤摘要】
肿瘤浸润淋巴细胞的培养方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体地涉及一种肿瘤浸润淋巴细胞培养方法。

技术介绍

[0002]自然杀伤(Natural Killer，NK)细胞是具有细胞毒性的、来源于淋巴器官的天然免疫细胞，其被认为占外周血淋巴细胞约5
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20％，其标志物主要为CD3
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CD56+CD16+。近年来，NK细胞用于肿瘤免疫治疗受到了越来越多的关注。目前在临床上通常是在分离的病人外周血PBMC中加入不同细胞因子组合进行培养扩增。为了获得能够用于临床级的具有肿瘤杀伤效果的NK细胞，需要的NK数量通常较大。而从患者身上采集到较大体积的血液通常比较困难，并且血液中NK细胞所占的比例也通常较低(5
‑
20％)，治疗的重点在于如何有效扩增NK细胞。已有报道将PBMC、CD3
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CD56+细胞、CD56+细胞等作为起始细胞，加入细胞因子如IL
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2、IL
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12、IL
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15或IL
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21及LPS或CD3抗体(如OKT
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3)、CD16抗体等进行NK细胞的离体扩增培养。但单独使用细胞因子、抗体和/或LPS进行离体培养时，NK细胞的扩增倍数仍远无法满足临床治疗所需的用量。基于此，使用膜表面表达NK细胞激活配体的细胞或经基因工程改造后在细胞膜表面表达细胞因子的细胞系在经过辐射处理后作为NK细胞体外大规模扩增的饲养细胞已成为NK细胞离体培养的常用手段。中国专利CN107002039B记载了一种使用T细胞用于培养NK细胞的方法，该方法使用CD4+T细胞作为饲养细胞增强NK细胞的增殖，所示使用的CD4+T细胞为H9或HuT78细胞系。中国专利CN104321425B记载了一种诱导和扩增源自PBMC的NK细胞的方法，其使用了经辐射的Jurkat细胞和经辐射的、由EB病毒转化的连续性淋巴细胞株(EBV
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LCL)作为饲养细胞与PBMC进行共培养。US20180155690A1记载了一种高纯度NK细胞培养方法，该方法使用经过辐射的PBMC作为饲养细胞，并使用CD16抗体对NK细胞进行刺激。
[0003]除了血液PBMC，在肿瘤组织中也存在浸润的NK细胞。对于部分瘤种如乳腺癌、肾癌、肺癌和头颈部鳞状细胞癌而言，NK的浸润可能预示了良好的预后。瘤床中的NK细胞可能通过与肿瘤细胞的直接相互作用或通过与其他免疫细胞之间的相互影响来控制肿瘤生长。在实体瘤尤其是高度晚期的实体瘤组织中，NK细胞通常的浸润能力比较低，并且浸润的NK通常会被肿瘤微环境(TME)中的多个通路所抑制。
[0004]目前，NK细胞的免疫治疗已经成功地被应用于部分血液肿瘤，如急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)，但针对实体瘤的NK细胞免疫治疗的临床应用不多，且已经应用的实体瘤NK疗法的治疗临床效果并不理想。现在最常见的NK细胞治疗中自体或异体外周血PBMC是最常见的NK细胞来源。与肿瘤浸润NK细胞相比，外周血NK细胞缺少表达肿瘤归巢相关的趋化因子受体(如CXCR3、CCR5、CCR7等)，导致外周血来源的NK细胞难以归巢至实体瘤并浸润至实体瘤内部，对实体肿瘤的杀伤效果十分有限。而实体瘤中天然状态下浸润的NK细胞不但数量较少，而且还普遍处于被肿瘤微环境免疫抑制的状态。因此，如果能从实体瘤组织中离体扩增培养获得足够临床治疗用量的肿瘤浸润NK细胞并将其由瘤内免疫抑制状态重新转变为激活状态，将可为NK细胞用于肿瘤免疫临床治疗提供一项全新的选
择。然而目前仍然缺乏有效离体扩增培养肿瘤浸润NK细胞的方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术第一方面提供一种肿瘤浸润淋巴细胞培养基，包括细胞因子、刺激型抗体和细胞培养成分，其中，所述细胞因子包括IL
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21和IL
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15，所述刺激型抗体包括CD28抗体和/或CD137抗体。
[0006]在一个或多个实施方案中，所述肿瘤浸润淋巴细胞培养基为肿瘤浸润NK细胞培养基。
[0007]在一个或多个实施方案中，所述肿瘤浸润淋巴细胞培养基用于培养肿瘤浸润NK细胞。优选地，所述肿瘤浸润NK细胞来自肿瘤组织。
[0008]在一个或多个实施方案中，所述肿瘤浸润淋巴细胞培养基用于培养肿瘤浸润NK细胞和T细胞的混合物。优选地，肿瘤浸润NK细胞和T细胞来自相同肿瘤组织或肿瘤体液。
[0009]在一个或多个实施方案中，所述培养基为血清培养基或无血清培养基。在一个或多个实施方案中，所述培养基还含有血清。优选地，血清浓度为0
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10(v/v)％，更优选为3
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5(v/v)％。
[0010]在一个或多个实施方案中，所述细胞培养成分为淋巴细胞基础培养基。
[0011]在一个或多个实施方案中，所述培养基中IL
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21的浓度为50
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4000U/mL，优选100
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3000U/mL，更优选200
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2000U/mL，更优选500
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1000U/mL。
[0012]在一个或多个实施方案中，所述培养基中IL
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15的浓度为500
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4000U/mL，优选1000
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3000U/mL，更优选1000
‑
2000U/mL。
[0013]在一个或多个实施方案中，所述培养基中CD28抗体的浓度为0
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200μg/mL，优选5
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100μg/mL，更优选10
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50μg/mL。
[0014]在一个或多个实施方案中，所述培养基中CD137抗体的浓度为0
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200μg/mL，优选10
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100μg/mL，更优选10
‑
25μg/mL。
[0015]在一个或多个实施方案中，所述肿瘤浸润淋巴细胞培养基还包括激活型抗体，所述激活型抗体包括选自CD40抗体、OX
‑
40抗体和CD16抗体中的任一种、两种或三种。
[0016]在一个或多个实施方案中，所述激活型抗体包括(1)CD16抗体、(2)CD40抗体和CD16抗体、(3)OX
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40抗体和CD16抗体。
[0017]在一个或多个实施方案中，所述培养基中CD40抗体的浓度为0
‑
200μg/mL，优选10
‑
100μg/mL，更优选10
‑
50μg/mL。
[0018]在一个或多个实施方案中，所述培养基中OX
‑
40抗体的浓度为0
‑
200μg/mL，优选10
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50μg/mL，更优选25μg/mL。
[0019]在一个或多个实施方案中，所述培养基中本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种肿瘤浸润淋巴细胞培养基，包括细胞因子、刺激型抗体和细胞培养成分，其中，所述细胞因子包括IL
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21和IL
‑
15，所述刺激型抗体包括CD28抗体和/或CD137抗体，优选地，所述培养基还具有选自以下的一个或多个特征：所述肿瘤浸润淋巴细胞培养基为肿瘤浸润NK细胞培养基，所述细胞培养成分为淋巴细胞基础培养基，所述培养基中IL
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21的浓度为50
‑
4000U/mL，优选100
‑
3000U/mL，所述培养基中IL
‑
15的浓度为500
‑
4000U/mL，优选1000
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3000U/mL，所述培养基中CD28抗体的浓度为0
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200μg/mL，优选5
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100μg/mL，所述培养基中CD137抗体的浓度为0
‑
200μg/mL，优选10
‑
100μg/mL，所述培养基包含或不包含血清或血清替代成分。2.如权利要求1所述的肿瘤浸润淋巴细胞培养基，其特征在于，所述肿瘤浸润淋巴细胞培养基还包括激活型抗体，所述激活型抗体包括选自CD40抗体、OX
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40抗体和CD16抗体中的任一种、两种或三种，优选地，所述培养基中CD40抗体的浓度为0
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200μg/mL，优选10
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100μg/mL，和/或所述培养基中OX
‑
40抗体的浓度为0
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200μg/mL，优选10
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50μg/mL，和/或所述培养基中CD16抗体的浓度为0
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200μg/mL，优选10
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100μg/mL。3.如权利要求1或2所述的肿瘤浸润淋巴细胞培养基，其特征在于，所述细胞因子还包括选自IL
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7、IL
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12、IL
‑
18和TNFα中的任一种或多种，优选地，所述培养基中IL
‑
7的浓度为0
‑
1500U/mL，优选100
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1000U/mL，所述培养基中IL
‑
12的浓度为0
‑
1500U/mL，优选100
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1000U/mL，所述培养基中IL
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18的浓度为0
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1500U/mL，优选200
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1000U/mL，所述培养基中TNFα的浓度为0
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500pg/mL，优选10
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100pg/mL。4.如权利要求1或2所述的肿瘤浸润淋巴细胞培养基，其特征在于，所述培养基还包括免疫检查点抑制剂；优选地，所述免疫检查点抑制剂包括选自PD
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1抗体、CTLA
‑
4抗体、TIM3抗体、Lag3抗体和TIGIT抗体中的任一种或多种。5.如权利要求4所述的肿瘤浸润淋巴细胞培养基，其特征在于，所述培养基中PD
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1抗体的浓度为0
‑
200μg/mL，优选10
‑
100μg/mL，和/或所述培养基中CTLA
‑
4抗体的浓度为0
‑
200μg/mL，优选10
‑
100μg/mL，和/或所述培养基中TIM3抗体的浓度为0<...

【专利技术属性】
技术研发人员：金华君，何周，李甜甜，郭静，马星明，黄晨，
申请(专利权)人：上海君赛生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：