CTL细胞的制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及细胞培养技术，尤其涉及CTL细胞的制备方法和应用。本发明专利技术提供了CTL细胞的制备方法，取甲型流感病毒M1蛋白的限制性表位肽负载DC细胞后与PBMC细胞混合，孵育后，获得所述CTL细胞；所述限制性表位肽包括：HLA

【技术实现步骤摘要】
CTL细胞的制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及细胞培养技术，尤其涉及CTL细胞的制备方法和应用。

技术介绍

[0002]病毒感染(viralinfection)是指病毒通过多种途径侵入机体，并在易感的宿主细胞中增殖的过程。人类病毒是指能感染人体或对人有致病作用的病毒。机体感染病毒后，可表现出不同的临床类型。依据有无症状，可分为显性感染和隐性感染；依据病毒滞留时间及症状持续时间长短，又可分为急性感染和持续性感染。
[0003]流行性感冒，简称流感，是由甲、乙、丙三型流感病毒分别引起的一种急性呼吸道疾病，属于丙类传染病。流感在中国以冬春季多见，临床表现以高热、乏力、头痛、咳嗽、全身肌肉酸痛等全身中毒症状为主，而呼吸道症状较轻。流感病毒容易发生变异，传染性强，人群普遍易感，发病率高，历史上在全世界引起多次暴发性流行，是全球关注的重要公共卫生问题。
[0004]虽然针对流感病毒感染引起的大流行病，我们已经开发出了疫苗进行保护，且取得了很好的效果，通过疫苗得到了有效控制。但是疫苗防护也有其局限性，对于健康人，疫苗效果好，但是对于已经被病毒感染的人群，疫苗并没有好的效果；尤其是病毒一旦潜伏下来，将基因整合进宿主基因组内部，此时基本没有有效的治疗手段。再有，流感病毒变异速度快，往往旧毒株的疫苗对新毒株并没有防护能力。
[0005]针对被病毒感染的细胞以及肿瘤细胞，我们人体内的免疫细胞是能够识别并清除这些细胞的。而且对于表面抗原变异的毒株侵染，免疫细胞能够在清除被感染细胞的同时，暴露这些变异抗原，从而一并将病毒清除。但是体内这种能清除特异性细胞的比例极低，导致病症反反复复发作。
[0006]近些年新兴起来的细胞治疗手段，就是利用我们自身的免疫细胞，在体外进行教化或者改造扩增，使其具有杀伤特定病毒感染细胞、肿瘤细胞的能力后，回输到体内后，杀伤病变细胞。细胞疗法用于抗病毒治疗有以下优点：1)可清除潜伏期感染
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尤其像艾滋、乙肝等潜伏期长的病毒感染；2)对表面抗原变异快速的病毒同样有效
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如流感、新冠等。
[0007]细胞治疗，属于免疫治疗的一种，使用患者自体的细胞(特殊情况下可以使用异体细胞)，在体外定向培养、改造后回输，用于治疗、预防疾病的手段。目前热门的病毒、肿瘤预防和治疗的细胞类赛道主要基于巨噬细胞，DC(Dendritic cells，DC)，NK(Natural Killer Cells，NK)，T细胞开发的药物。
[0008]树突状细胞是人体内功能最强的专职抗原递呈细胞，DC相当于信使，将抗原信息传递给T细胞，并具有活化T细胞的功能，很少量就可以激发强大的T细胞反应。DC是人体最强大的抗原递呈细胞，可致敏辅助T细胞的多种细胞因子，显著刺激初始型T细胞增殖，以激活体内静止状态的初始型T细胞(而巨噬细胞、B细胞仅能刺激已活化的或记忆性T细胞)。
[0009]自DC细胞功能被验证后，应用DC细胞进行临床技术开发用于预防、治疗病毒感染及肿瘤进行的如火如荼，但是收效甚微，截止目前为止，全球仅有4个基于DC细胞获批的上
市药物。究其原因，主要是DC细胞获取困难：1)DC细胞在PBMC中的含量极少，低于1％，且分离成本很高；2)DC细胞体外不具备增殖能力；3)现有基于诱导单核细胞获取MoDC(monocyte
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derivedDCs，MODC)的数量少、成本高。

技术实现思路

[0010]有鉴于此，本专利技术提供了CTL细胞的制备方法和应用。本专利技术立足于可体外增殖的DC细胞株技术，开发DC诱导的细胞毒性T细胞(Cytotoxic T Lymphocytes，CTL)的细胞治疗方法。以人甲型流感H1N1的M1蛋白的HLA
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A*02:01限制性表位为靶点，培养CTL并验证其因子分泌和特异性杀伤能力，为预防、治疗流感病毒感染，尤其是潜伏感染提供细胞治疗的新方法。
[0011]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0012]本专利技术提供了CTL细胞的制备方法，取甲型流感病毒M1蛋白的限制性表位肽负载DC细胞后与PBMC细胞混合，孵育后，获得所述CTL细胞；所述限制性表位肽包括：HLA
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A*02:01；所述限制性表位肽的氨基酸序列具有：
[0013](1)、如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；或
[0014](2)、如(1)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基获得的氨基酸序列，且与(1)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；或
[0015](3)、与(1)或(2)所示的氨基酸序列至少有80％同一性的氨基酸序列。
[0016]在本专利技术的一些实施方案中，上述制备方法中，SEQ ID NO:1的序列为：GILGFVFTL。
[0017]在本专利技术的一些实施方案中，上述制备方法中，所述限制性表位肽的浓度为10μg/mL。
[0018]在本专利技术的一些实施方案中，上述制备方法中，所述负载的时间为4h。
[0019]在本专利技术的一些实施方案中，上述制备方法中，所述孵育的温度为37℃，时间为24h。
[0020]在本专利技术的一些实施方案中，上述制备方法中，所述DC细胞与所述PBMC细胞的数量比为100:1。
[0021]在本专利技术的一些实施方案中，上述制备方法中，所述DC细胞的制备方法包括以下步骤：
[0022]S1：取所述PBMC细胞接种培养后，保留贴壁细胞，刺激培养后，获得MODC细胞；
[0023]S2：取慢病毒载体转化或转染所述MODC细胞，培养，获得所述DC细胞。
[0024]在本专利技术的一些实施方案中，上述制备方法S1中所述接种时的细胞数为4
×
106个/mL。
[0025]在本专利技术的一些实施方案中，上述制备方法S1中所述刺激培养包括第一刺激培养和第二刺激培养；所述第一刺激培养采用1000IU/mL的GM
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CSF和500IU/mL的IL
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4，时间为6d；所述第二刺激培养采用50μg/mL的TNF
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a，时间为24h。
[0026]在本专利技术的一些实施方案中，上述制备方法S2中所述慢病毒载体包括：SV40大T抗原和Myc
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ER融合蛋白。
[0027]本专利技术还提供了上述制备方法获得的CTL细胞在制备预防或治疗流感病毒的药物
中的应用。
[0028]本专利技术提供了CTL细胞的制备方法，取甲型流感病毒M1蛋白的限制性表位肽负载DC细胞后与PBMC细胞混合，孵育后，获得所述CTL细胞；所述限制性表位肽包括：HLA
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A*02:01；所述限制性表位肽的氨基酸序列具有：(1)、如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；或(2)、如(1)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基获得的氨基酸序列，且与(1)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.CTL细胞的制备方法，其特征在于，取甲型流感病毒M1蛋白的限制性表位肽负载DC细胞后与PBMC细胞混合，孵育后，获得所述CTL细胞；所述限制性表位肽包括：HLA
‑
A*02:01；所述限制性表位肽的氨基酸序列具有：(1)、如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；或(2)、如(1)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基获得的氨基酸序列，且与(1)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；或(3)、与(1)或(2)所示的氨基酸序列至少有80％同一性的氨基酸序列。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述限制性表位肽的浓度为10μg/mL。3.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述负载的时间为4h。4.如权利要求1至3任一项所述的制备方法，其特征在于，所述孵育的温度为37℃，时间为24h。5.如权利要求1至4任一项所述的制备方法，其特征在于，所述DC细胞与所述PBMC细胞的数量比为100:1。6.如权利要求1至5任一项所述的制备方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：田光启，韩晓林，刘书磊，
申请(专利权)人：北京惠大生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：