【技术实现步骤摘要】
含芳基硫酚或芳基硒酚经修饰的氨基酸、重组蛋白及其生物合成方法及应用
[0001]本专利技术属于生物医药领域,涉及非天然氨基酸、重组蛋白及其制备方法及应用,具体涉及含芳基硫酚或芳基硒酚经修饰的氨基酸、重组蛋白及其生物合成方法及应用。
技术介绍
[0002]蛋白质不仅是细胞的组成成分之一,而且是细胞功能的主要执行者。自然界中蛋白质由20种天然氨基酸组成,这些天然氨基酸不同的理化性质赋予蛋白质结构和功能多样性。但是天然氨基酸因其结构类型的局限,限制了新型蛋白的开发。于是科学家在这20种天然氨基酸的基础上创造出能够编码蛋白质的新型非天然氨基酸(ncAAs)结构,极大丰富了蛋白质的结构与功能并且在化学生物学研究领域发挥着重要的作用。
[0003]基因密码子扩展技术便是其中之一,其能实现在生物体内任意目标蛋白的特定位点引入ncAAs。这一技术是利用与宿主细胞生物正交的氨酰tRNA合成酶(aminoacyl
‑
tRNA synthetase,aaRS)/tRNA对,在蛋白中突变的终止密码子(UAG/UGA/UAA)位点插入ncAAs,得到定点编码非天然氨基酸的蛋白质,该技术可在蛋白的任意位点定点引入非天然氨基酸。
[0004]蛋白质药物如工程化抗体,重组蛋白等在治疗棘手的重大疾病和慢性疾病方面有重要应用,如肿瘤和免疫系统等疾病。蛋白质化学修饰技术,在蛋白上修饰效应分子,赋予蛋白质新功能,可成为更强大的诊断工具或者治疗武器。例如,在蛋白质的特定氨基酸上化学标记荧光基团来追踪蛋白质在细胞内的定位和动态 ...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.含芳基硫酚或芳基硒酚经修饰的氨基酸,其特征在于,具有如下式(1)所示通式:或其盐或其前药,其中,A为S或者Se,m和n相同或不同,m和n为0
‑
3之间的整数;U为(C0‑
C4)直链或者支链烷基;G为叠氮基,乙酰基,四嗪基,2
‑
氧代丙酰胺基团,硼酸基,醛基,氰基,羧基,三氟甲基或巯基;含G官能团的键仅在苯环的邻位,间位或者对位,或者同时存在于任意两个相同或不同位置;G1,G2和G3中的一个可以是
‑
N
‑
,或者
‑
C
‑
,且G1,G2和G3中的其余者独立的为
‑
CH
‑
。其中,当G分别取自叠氮基,醛基,氰基,羧基时,U为C0烷基;当G分别取自硼酸基,巯基时,m为0,同时U为C0烷基。2.如权利要求1所述的含芳基硫酚或芳基硒酚经修饰的氨基酸,其特征在于,A为S。3.如权利要求1所述的含芳基硫酚或芳基硒酚经修饰的氨基酸,其特征在于,A为Se。4.如权利要求1所述的含芳基硫酚或芳基硒酚经修饰的氨基酸,其特征在于,G为叠氮基,具有如下式(2)所示通式:其中,m为0
‑
3之间的整数;叠氮基的键仅在苯环的邻位,间位或者对位,或者同时存在于任意两个相同或不同位置。5.如权利要求1所述的含芳基硫酚或芳基硒酚经修饰的氨基酸,其特征在于,G为乙酰基,具有如下式(3)所示通式:
其中,m为0
‑
3之间的整数;乙酰基的键仅在苯环的邻位,间位或者对位,或者同时存在于任意两个相同或不同位置。6.如权利要求1所述的含芳基硫酚或芳基硒酚经修饰的氨基酸,其特征在于,G为四嗪基,具有如下式(4)所示通式:其中,m为0
‑
3之间的整数;四嗪基的键仅在苯环的邻位,间位或者对位,或者同时存在于任意两个相同或不同位置。7.如权利要求1所述的含芳基硫酚或芳基硒酚经修饰的氨基酸,其特征在于,所述含芳基硫酚或芳基硒酚经修饰的氨基酸具体为如下式S
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1至S
‑
70或Se
‑
1至Se
‑
69中的任一式的化合物:
8.一种重组蛋白,其特征在于,所述重组蛋白包含如权利要求1
‑
5中任一项所述的含芳基硫酚或芳基硒酚经修饰的氨基酸的一个或多个残基。9.一种偶联物,其特征在于,包含连接于偶联剂的如权利要求6所述的重组蛋白,且所述偶联物任选地包含所述抗体和所述偶联剂之间的连接部分。10.如权利要求9所述的偶联物,其特征在于,所述偶联剂为药物分子、荧光分子或PEG,连接部分为羟胺衍生物、DBCO衍生物、降冰片烯衍生物、BCN衍生物、环丙烯基团或反式环辛烯基团。11.一种含芳基硫酚或芳基硒酚经修饰的氨基酸的生物合成方法,其特征在于,包括如
下步骤:1)构建带有半胱氨酸合成酶CysM基因和O
‑
乙酰丝氨酸转移酶NtSat4基因或AtSat3基因的辅助质粒a.使用带有持续性表达启动子Trc1序列的半胱氨酸合成酶CysM基因的引物从大肠杆菌基因组中扩增得到半胱氨酸合成酶CysM基因,使得该半胱氨酸合成酶CysM基因的前面融合Trc1启动子;将该半胱氨酸合成酶CysM基因通过Gibson组装方法克隆到含有p15a复制起点的大肠杆菌pBK表达载体中,该载体含有卡那霉素抗性基因,得到pBK
‑
CysM质粒;b.合成带有O
‑
乙酰丝氨酸转移酶NtSat4基因的质粒或带有O
‑
乙酰丝氨酸转移酶AtSat3基因的质粒,使用带有持续性表达启动子IPP序列的NtSat4基因的引物或带有持续性表达启动子IPP序列的AtSat3基因的引物从带有NtSat4或AtSat3基因的质粒中扩增得到带有持续性表达启动子IPP的NtSat4或AtSat3基因的片段;将该NtSat4基因或AtSat3基因的片段通过Gibson组装方式克隆到pBK
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CysM载体中,得到辅助质粒pBK
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CysM
‑
NtSat4或pBK
‑
CysM
‑
AtSat3;2)制备表达含芳基硫酚或芳基硒酚经修饰的氨基酸的菌株将质粒pBK
‑
CysM
‑
NtSat4或质粒pBK
‑
CysM
‑
AtSat3转化到BL21(DE3)中,得到合成含芳基硫酚或芳基硒酚经修饰的氨基酸的菌株BL
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pBK
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CysM
‑
NtSat4或BL
‑
pBK
‑
CysM
‑
AtSat3;3)含芳基硫酚或芳基硒酚经修饰的氨基酸的合成将菌株BL
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pBK
‑
CysM
‑
NtSat4或BL
‑
pBK
‑
CysM
‑
AtSat3接种在5mL含有50μg/ml卡那霉素的2YT培养基中,过夜培养,次日按照接种量为1:100体积比转接于20mL含有50μg/ml卡那霉素的2YT培养基中,培养至对数生长初期,添加1mM芳香巯/硒基前体分子,在37℃,220转速的摇床中培养12小时;吸取1mL菌液,12000转速离心2分钟,吸取培养基上清,用0.22μm滤膜过滤,分离纯化氨基酸,这种分离氨基酸的方法是本领域技术人员公知的,其中包括过滤,离心,萃取,吸附,离子交换色谱,沉淀和结晶。12.如权利要求11所述的含芳基硫酚或芳基硒酚经修饰的氨基酸的生物合成方法,其特征在于,步骤1)所述的带有持续性表达启动子Trc1序列的半胱氨酸合成酶CysM基因的引物由上游引物CysM
‑
Trc1
‑
F1、CysM
‑
Trc1
‑
F2、CysM
‑
Trc1
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F3和下游引物CysM
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R组成;其中,CysM
‑
Trc1
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F1的核苷酸序列如Seq ID No.1所示;CysM<...
【专利技术属性】
技术研发人员:刘涛,王永,陈晓旭,蔡文康,
申请(专利权)人:北京惠大生物科技有限公司,
类型:发明
国别省市:
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