一种高效扩增NK细胞的方法技术

本发明专利技术提供了一种高效扩增NK细胞的方法,属于免疫学技术领域。本发明专利技术所提供的方法首先将获取的NK细胞接种于细胞培养皿中；接着加入含有左旋紫草素的NK细胞培养基，将细胞培养皿置于细胞培养箱中进行培养；之后每隔2

【技术实现步骤摘要】
一种高效扩增NK细胞的方法


[0001]本专利技术属于免疫学
，尤其涉及一种高效扩增NK细胞的方法。

技术介绍

[0002]NK细胞也被称之为自然杀伤细胞，约占外周血淋巴细胞的10％
‑
15％。NK细胞是连接机体固有免疫和获得性免疫的桥梁，NK细胞被激活后会通过分泌IFN
‑
γ、穿孔素等效应分子作用于靶细胞，从而发挥对靶细胞的杀伤效应。而且，NK细胞在移植后不会引起宿主产生移植性宿主病。因此，NK在机体抗感染性疾病和恶性肿瘤的免疫监视过程中均发挥着重要的作用。
[0003]然而，由于NK细胞仅占外周血淋巴细胞中的很少一部分，因此NK细胞的免疫治疗受到限制，很难满足巨大的临床需求，因此实现体外快速扩增NK细胞是目前急需解决的问题。
[0004]NK细胞的主要功能之一是用于抑制肿瘤细胞，因此，本专利技术猜想是否抑制肿瘤的药物也同样可以发挥促进NK细胞的功能。本专利技术选择了3种可以对肿瘤细胞发挥抑制作用的左旋紫草素，蔓荆子黄素，大花旋覆花素来检测其中是否存在可以对NK细胞的增殖发挥促进作用的药物。
[0005]左旋紫草素的分子式为C
16
H
16
O5，分子量为288.3，CAS号为：517
‑
88
‑
4，结构式为
[0006]
技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种高效扩增NK细胞的方法。
[0008]为实现上述目的，第一方面，本专利技术提供了一种高效扩增NK细胞的方法，所述方法包括如下步骤：
[0009](1)将获取的NK细胞接种于细胞培养皿中；
[0010](2)加入含有左旋紫草素的NK细胞培养基，将细胞培养皿置于细胞培养箱中进行培养；
[0011](3)每隔2
‑
3d进行一次换液，培养14d即可得到具有高杀伤率的NK细胞。
[0012]优选地，所述NK培养基中左旋紫草素的终浓度为0.5μmol/L
‑
16μmol/L。
[0013]优选地，所述NK培养基中左旋紫草素的终浓度为4μmol/L。
[0014]优选地，所述左旋紫草素的CAS号为：517
‑
88
‑
4。
[0015]第二方面，本专利技术提供了左旋紫草素在制备提高NK细胞扩增能力的培养基中的应
用。
[0016]优选地，所述培养基中所述左旋紫草素的终浓度为0.5μmol/L
‑
16μmol/L；
[0017]所述左旋紫草素的CAS号为：517
‑
88
‑
4。
[0018]优选地，所述培养基中所述左旋紫草素的终浓度为4μmol/L。
[0019]第三方面，本专利技术提供了左旋紫草素在制备提高NK细胞杀伤活性的培养基中的应用。
[0020]优选地，所述培养基中所述左旋紫草素的终浓度为0.5μmol/L
‑
16μmol/L；
[0021]所述左旋紫草素的CAS号为：517
‑
88
‑
4；
[0022]所述左旋紫草素增加NK细胞中颗粒酶B和穿孔素的蛋白表达水平。
[0023]优选地，所述培养基中所述左旋紫草素的终浓度为4μmol/L。
[0024]本专利技术的有益效果在于：
[0025]本专利技术发现了能够有效的促进NK细胞扩增能力的左旋紫草素，同时本专利技术发现左旋紫草素能够提高NK细胞对于宫颈癌细胞HeLa细胞的杀伤率；
[0026]此外，本专利技术发现左旋紫草素能够有效的提高NK细胞中颗粒酶B和穿孔素的蛋白表达。
附图说明
[0027]图1为1μmol/L左旋紫草素，1μmol/L蔓荆子黄素，1μmol/L大花旋覆花素对于NK细胞增殖影响的检测结果；
[0028]图2为0.5μmol/L，1μmol/L，2μmol/L,4μmol/L,8μmol/L,16μmol/L左旋紫草素对于NK细胞增殖影响的检测结果；
[0029]图3为2μmol/L左旋紫草素，4μmol/L左旋紫草素对于NK细胞中颗粒酶素B和穿孔素蛋白表达影响的检测结果。
具体实施方式
[0030]实施例1:制备NK细胞
[0031]1.将成人外周血置于离心机中2000r/min离心10min后，小心的吸出血浆至新的离心管中；
[0032]2.血细胞用生理盐水稀释后加入到装有Ficoll溶液的离心管中，放入离心机中2000r/min离心20min；
[0033]3.收集白膜层细胞，使用生理盐水洗涤2次后，计数后备用；
[0034]4.使用30ml NK细胞培养基(CellGro SCGM)将2
×
107个白膜层细胞重悬后，接入到T75细胞培养瓶中；
[0035]5.加入500U/ml的IL
‑
2，1
×
106cell/ml的滋养层细胞，5％自体血浆，置于37℃5％CO2条件下培养14d左右，每天对细胞进行计数，当细胞密度超过2.5
×
106cell/ml时补充培养基；
[0036]6.第7d补加一次滋养细胞，待流式细胞仪检测CD3
‑
CD56
+
细胞百分比超过90％后，即得到NK细胞并用于后续实验。
[0037]实施例2：检测左旋紫草素，蔓荆子黄素，大花旋覆花素是否可以促进NK细胞增
[0038](1)收集NK细胞并进行计数，按照5
×
104个/孔接种至96孔板中，置于细胞培养箱中过夜；
[0039](2)去除培养基，分别加入终浓度为0μmol/L，1μmol/L左旋紫草素，1μmol/L蔓荆子黄素，1μmol/L大花旋覆花素，放置在细胞培养箱中培养48h；
[0040](3)达到设定时间后，每孔加入20μl MTT试剂，继续培养4h后，弃去上清，加入150μl二甲亚砜试剂，轻轻震荡10min；
[0041](4)放入酶标仪中，检测490nm处各孔的吸光度，检测细胞增值率(％)，细胞增值率＝(实验组吸光度
‑
对照组吸光度)/对照组吸光度
×
100％。
[0042]实施例3：检测不同浓度的左旋紫草素对于NK细胞增殖的影响
[0043](1)收集NK细胞并进行计数，按照5
×
104个/孔接种至96孔板中，置于细胞培养箱中过夜；
[0044](2)去除培养基，分别加入终浓度为0μmol/L，0.5μmol/L，1μmol/L，2μmol/L,4μmol/L,8μmol/L,16μmol/L左旋紫草素，放置在细胞培养箱中培养48h；
[0045](3)达到设定时间后，每孔加入20μl MTT试剂，继续培养4h后，弃去上清，加入150μl二甲亚本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高效扩增NK细胞的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)将获取的NK细胞接种于细胞培养皿中；(2)加入含有左旋紫草素的NK细胞培养基，将细胞培养皿置于细胞培养箱中进行培养；(3)每隔2
‑
3d进行一次换液，培养14d即可得到具有高杀伤率的NK细胞。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述NK培养基中左旋紫草素的终浓度为0.5μmol/L
‑
16μmol/L。3.根据权利要求2所示的方法，其特征在于，所述NK培养基中左旋紫草素的终浓度为4μmol/L。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述左旋紫草素的CAS号为：517
‑
88
‑
4。5.左旋紫草素在制备提高NK细胞扩增能力的培养基中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：王舒怡，魏国庆，
申请(专利权)人：青岛思拓新源细胞医学有限公司，
类型：发明
国别省市：