一种来源于胸腹水的T淋巴细胞的制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种来源于胸腹水的T淋巴细胞的制备方法及应用，通过分离筛选胸腹水内的肿瘤特异性T淋巴细胞，并对符合要求的种子细胞进行扩增培养、磁珠筛选、冻存，具有所需样本量少、可多次应用、纯度较高的优势。本发明专利技术将冻存种子细胞复苏后经CD3/CD28、IFN

【技术实现步骤摘要】
一种来源于胸腹水的T淋巴细胞的制备方法及应用


[0001]本专利技术涉及T淋巴细胞制剂领域，特别涉及一种来源于胸腹水的T淋巴细胞的制备方法及应用。

技术介绍

[0002]恶性肿瘤是威胁人类健康的疾病之一。恶性胸腹水又称恶性胸腔积液，是晚期恶性肿瘤常见的并发症，威胁着患者的生命安全，影响患者的生活质量。
[0003]正常人体内，胸腹腔和心包腔内仅有少量液体发挥润滑功能，一般情况下胸腔内的液体量＜200mL，腹腔内的液体量＜50mL即可维持正常的心肺功能。当胸腹腔出现恶性肿瘤细胞浸润或炎症时，腔内积液就会增多，并且逐渐积聚，积液的性质也随之发生变化。
[0004]肿瘤浸润淋巴细胞(tumor
‑
infiltrating lymphocyte,TIL)是存在于肿瘤间质内的以淋巴细胞为主的异质性淋巴细胞群体，大多聚集在肿瘤周围或其间质呈套状围绕癌巢。其主要成分是存在于肿瘤间质内的T淋巴细胞，即具有肿瘤特异性杀伤效果的T淋巴细胞，小部分为MHC非限制性的NK细胞，其共同特征为表达T细胞受体(T cell receptor,TCR)。TIL细胞治疗肿瘤是当前肿瘤生物学治疗研究的热点之一。TIL细胞的优点是：1.具有较强的抗肿瘤作用；2.可特异识别自体肿瘤,具有特异的MHC限制性溶解肿瘤活性；3.除对肿瘤细胞有直接杀伤作用外，回输后TIL细胞还能增强患者的抗肿瘤免疫功能从而提高疗效。
[0005]临床所见的大量胸腔积液大约40％是由恶性肿瘤引起，最常见的为肺癌、乳腺癌和淋巴瘤，此时患者已不具备手术治疗的条件，而全身的化疗、放疗使耐受性较差的患者难以承受。自体TIL细胞过继免疫疗法是近年发展起来治疗恶性胸腔积液的较为成熟、有效且低毒的方法。恶性胸腔积液中的淋巴细胞是一种特殊形式的TIL细胞，其特点是可对自体内生长的实体瘤进行特异性杀伤，而对其他种类肿瘤和正常组织细胞则无杀伤作用。
[0006]肿瘤进展与肿瘤中CD8
+
T淋巴细胞浸润之间存在相关性，CD8
+
T细胞被认为直接参与抗肿瘤细胞毒性反应。Ahrends等认为CD4
+
T细胞帮助细胞毒性T细(CTL)表达细胞毒性效应分子，抑制受体下调和增加迁移能力。有报道显示，癌症组织内浸润的CD8
+
细胞的数量与患者预后呈正相关，其数量越多，预后就越好。
[0007]综上，申请人认为分离筛选肿瘤患者胸腹水内的肿瘤特异性杀伤效果的T淋巴细胞并对符合要求的种子细胞进行扩增培养，快速获得临床治疗数量的特异性T淋巴细胞具有重要的意义。

技术实现思路

[0008]本专利技术所要解决的技术问题是，提供一种来源于胸腹水的T淋巴细胞的制备方法及应用，可大大提高具有特异性识别肿瘤抗原的细胞比例，免磁珠残留，确保制剂细胞品质。
[0009]为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是：一种来源于胸腹水的T淋巴细
胞的制备方法，包括以下步骤：
[0010]S1.将胸腹水样本离心、洗涤，用培养基重悬细胞并计数；
[0011]S2.取(2.0
‑
3.0)
×
107个步骤S1获得的细胞加入到预先包被的细胞培养瓶中，加入完全培养基至细胞终浓度0.4
‑
0.6
×
109/L，补加IFN
‑
γ至终浓度500
‑
2000IU/mL，进行细胞培养；
[0012]S3.当细胞数达到(1.0
‑
1.2)
×
108时，根据计数以CD4
+
磁珠分选细胞悬液，阴选细胞悬液取计数，剩余阴选细胞悬液加入至新的培养瓶，根据细胞计数补加完全培养基将细胞浓度调整至(0.4
‑
0.6)
×
109/L，进行连续培养；
[0013]S4.当培养体系终体积达到100
‑
120mL时，每日进行细胞计数，直到细胞数增至(1.6
‑
2.0)
×
108时，回收全部细胞并冻存于4
‑
6支冻存管，此时细胞数满足4
‑
6次应用；
[0014]S5.复苏1支步骤S4冻存的细胞加入到预先包被的细胞培养瓶中，根据冻存细胞数，加入完全培养基至细胞终浓度(0.4
‑
0.6)
×
109/L，补加IFN
‑
γ至终浓度500
‑
2000IU/mL，进行细胞培养；
[0015]S6.培养24
‑
48h后，取细胞悬液计数，将其余细胞悬液全部转移至预先包被的细胞培养瓶中，根据计数结果，补加完全培养基将细胞浓度调整为(0.4
‑
0.6)
×
109/L，补加IFN
‑
γ至终浓度500
‑
2000IU/mL，进行细胞培养；
[0016]S7.当培养体系总体积为180
‑
200mL时，取细胞悬液计数，将其余细胞悬液全部转移至细胞培养袋中，根据细胞计数补加完全培养基将细胞浓度调整至(0.4
‑
0.6)
×
109/L，按照20
‑
50ng/mL向培养袋中补加CD3和CD28单抗，继续进行细胞培养；
[0017]S8.当培养体系终体积达到1.6
‑
2.0L时，每日进行细胞计数，直到细胞数增至(4.0
‑
6.0)
×
109以上时，回收全部细胞。
[0018]所述预先包被的细胞培养瓶的方法为：用含有CD3和CD28单抗的T淋巴细胞完全培养基包被培养瓶置于37℃，5.0％ CO2条件下0.5
‑
1h。
[0019]所述步骤S2、S3、S6、S7中每日观察细胞状态，每间隔24h
‑
48h取细胞悬液计数，根据细胞计数补加完全培养基将细胞浓度调整至(0.4
‑
0.6)
×
109/L，进行连续培养。
[0020]所述完全培养基为含有体积分数10
‑
20v％胎牛血清、4000
‑
6000IU/mL白细胞介素2和体积分数2％50X必需氨基酸的X
‑
VIVO 15培养基。
[0021]步骤S2、S5、S6、S7中，CD3和CD28两种单抗的含量为20
‑
50ng/cm2。
[0022]上述的制备方法制得的来源于胸腹水的T淋巴细胞在制备肿瘤特异性药物中的应用。
[0023]上述制备方法制备得到的来源于胸腹水的T淋巴细胞。
[0024]一种肿瘤特异性杀伤效果的T淋巴细胞制剂，包括上述的来源于胸腹水的T淋巴细胞。
[0025]本专利技术的有益效果是：可通过患者胸腹水获得肿瘤特异性杀本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种来源于胸腹水的T淋巴细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.将胸腹水样本离心、洗涤，用培养基重悬细胞并计数；S2.取(2.0
‑
3.0)
×
107个步骤S1获得的细胞加入到预先包被的细胞培养瓶中，加入完全培养基至细胞终浓度0.4
‑
0.6
×
109/L，补加IFN
‑
γ至终浓度500
‑
2000IU/mL，进行细胞培养；S3.当细胞数达到(1.0
‑
1.2)
×
108时，根据计数以CD4
+
磁珠分选细胞悬液，阴选细胞悬液取计数，剩余阴选细胞悬液加入至新的培养瓶，根据细胞计数补加完全培养基将细胞浓度调整至(0.4
‑
0.6)
×
109/L，进行连续培养；S4.当培养体系终体积达到100
‑
120mL时，每日进行细胞计数，直到细胞数增至(1.6
‑
2.0)
×
108时，回收全部细胞并冻存于4
‑
6支冻存管，此时细胞数满足4
‑
6次应用；S5.复苏1支步骤S4冻存的细胞加入到预先包被的细胞培养瓶中，根据冻存细胞数，加入完全培养基至细胞终浓度(0.4
‑
0.6)
×
109/L，补加IFN
‑
γ至终浓度500
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2000IU/mL，进行细胞培养；S6.培养24
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48h后，取细胞悬液计数，将其余细胞悬液全部转移至预先包被的细胞培养瓶中，根据计数结果，补加完全培养基将细胞浓度调整为(0.4
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0.6)
×
109/L，补加IFN
‑
γ至终浓度500
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2000IU/mL，进行细胞培养；S7.当培养体系总体积为180
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩洪起，王小宇，韩颢，冯春玲，吴学涛，陈晓波，
申请(专利权)人：优赛生命科学发展有限公司，
类型：发明
国别省市：