一种通过固定化提高2-脱氧-D-核糖-5-磷酸醛缩酶活性的方法技术

本发明专利技术提供了一种通过固定化提高2

【技术实现步骤摘要】
一种通过固定化提高2
‑
脱氧
‑
D
‑
核糖
‑5‑
磷酸醛缩酶活性的方法


[0001]本专利技术涉及生物催化领域，具体涉及一种通过固定化提高2
‑
脱氧
‑
D
‑
核糖
‑5‑
磷酸醛缩酶活性的方法。

技术介绍

[0002]2‑
脱氧
‑
D
‑
核糖
‑5‑
磷酸醛缩酶(2
‑
deoxy
‑
d
‑
ribose
‑5‑
phosphate aldolase,DERA,EC 4.1.2.4)是乙醛依赖性的I类醛缩酶，能够介导乙醛供体和各种受体底物之间的立体选择性C
‑
C键形成,产生新的手性中心(J.Rouvinen,M.Andberg,Appl Microbiol Biotechnol,2021,105(16
‑
17):6215
‑
6228)。DERA广泛分布于各种细菌、真菌、植物、哺乳动物细胞中，在生物体的核酸代谢中发挥重要作用。DERA催化的醇醛缩合反应在温和条件下进行，通过在供体底物和酶活性位点赖氨酸残基的氨基基团之间形成希夫碱，随后活化的供体经烯胺中间体立体选择性地添加到醛受体中生成多个手性中心。基于DERA的这一反应特性，已将其应用于多种化学品的工业化生产，包括季戊四醇、脱氧糖、香料和复杂药物分子。最受关注的是DERA应用于合成降血脂他汀类药物(阿托伐他汀和瑞舒伐他汀)的手性侧链，具有明显的优势(W.Greenberg,A.Varvak.Proc Natl Acad Sci U S A.2004,101(16):5788
‑
93)。然而，实际使用过程中存在酶对底物敏感易失活、底物抑制、酶无法回收利用等问题。因此，DERA的固定化不但能提高稳定性，而且可以重复利用，能够有效提高DERA的工业化应用价值。
[0003]酶固定化是指将游离酶束缚在一定空间或一个载体上,限制游离酶的自由流动,使其长时间发挥催化作用并可回收重复利用。固定化可以增加酶的稳定性、有机溶剂耐受性、循环利用性、储存稳定性等，是一种改善酶的理化性质的优良方法。固定化方法主要包括吸附、交联、包埋以及共价结合四种。这些方法所使用的材料较容易获取，也比较成熟，但也有不少缺陷，如包埋固定后酶的底物及产物不易扩散，共价结合法容易导致酶失活，而交联酶的机械性能比较差，等等。在酶的固定化方法中，吸附法操作简单，成本低，具有独特的优势。吸附法通过载体和酶分子自身结构之间产生的非特异性物理吸附、离子吸附、生物特异性吸附、亲和吸附和疏水作用等将酶分子固定在载体上。虽然利用吸附法固定酶的特异性不是很高，但该方法操作简便，不发生化学反应，不会改变酶的天然结构，能防止酶活性位点的功能受到破坏，保持酶处于天然状态，得到了广泛的应用(T.Jesionowski；J.Zdarta,Adsorption.2014,20:801
–
821)。
[0004]吸附法固定酶通常使用的材料包括二氧化硅、羟基磷灰石、硅藻土、活性炭以及纳米材料等。硅藻土在矿物学上属蛋白石结构，是重要的非金属矿物材料。它具有独特的硅藻壳体结构，外观形貌有圆盘状、直链状、羽状、针状等，特点是吸附性强、比表面积大、孔隙度高，在化工、石油、建材等许多工业领域均有应用。其中，以硅藻土为原料制备助滤剂、吸附剂和载体方面的应用最为广泛(袁鹏,吴大清.矿物岩石.2000(01):101
‑
104)。除此之外，硅藻土具有耐酸耐热的特性、优异的生物相容性以及对人体无毒副作用。

技术实现思路

[0005]本专利技术在克服目前2
‑
脱氧
‑
D
‑
核糖
‑5‑
磷酸醛缩酶实际应用中易失活、难回收、环境耐受性差、循环利用率低的问题的过程中，比较各种固定化材料对DERA的固定化效果时偶然发现了一种通过固定化提高2
‑
脱氧
‑
D
‑
核糖
‑5‑
磷酸醛缩酶活性的材料和方法，所述方法能够有效提高DERA的醛缩酶活性。所述方法不但使DERA的酶活保留率比其他固定化方式都更好，而且利用硅藻土对DERA进行固定激活步骤简单、条件温和、操作方便。
[0006]本专利技术具体技术方案如下：
[0007]一种提高2
‑
脱氧
‑
D
‑
核糖
‑5‑
磷酸醛缩酶活性的的方法，向含有2
‑
脱氧
‑
D
‑
核糖
‑5‑
磷酸醛缩酶的溶液加入硅藻土进行吸附、固定。
[0008]优选的，含有2
‑
脱氧
‑
D
‑
核糖
‑5‑
磷酸醛缩酶的溶液蛋白浓度为5～50mg/ml，每1ml溶液中加入20～200mg硅藻土。更优选的，含有2
‑
脱氧
‑
D
‑
核糖
‑5‑
磷酸醛缩酶的溶液蛋白浓度为10～20mg/ml，每1ml溶液中加入50～150mg硅藻土
[0009]优选的，所述含有2
‑
脱氧
‑
D
‑
核糖
‑5‑
磷酸醛缩酶的溶液为pH为4.0～10.0的缓冲液。更优选的，所述缓冲液的pH为7.0，浓度为0.01mol/L。本专利技术一个具体的示例为磷酸盐缓冲液。
[0010]优选的，所述固定时间为1～24h。更优选2h。
[0011]本专利技术所述的方法，所述2
‑
脱氧
‑
D
‑
核糖
‑5‑
磷酸醛缩酶来源于细菌、古菌、真菌、环境微生物、不可培养微生物、植物、动物等。
[0012]本专利技术所述的方法，一个具体的示例包括以下步骤：
[0013](1)收取发酵培养获得的含有2
‑
脱氧
‑
D
‑
核糖
‑5‑
磷酸醛缩酶基因的重组工程菌株的菌体，用缓冲液重悬得到菌悬液；
[0014](2)菌体破碎后离心收取上清，获粗酶液；
[0015](3)向粗酶液中加入硅藻土，震荡吸附固定；
[0016](4)固定化结束后离心收集沉淀，洗涤后冷冻干燥，即得固定化激活的2
‑
脱氧
‑
D
‑
核糖
‑5‑
磷酸醛缩酶。
[0017]进一步地，步骤(1)所述的缓冲液的pH为4.0～10.0，优选缓冲液的pH为7.0，浓度为0.01mol/L。
[0018]进一步地，步骤(1)本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高2
‑
脱氧
‑
D
‑
核糖
‑5‑
磷酸醛缩酶活性的方法，其特征在于，向含有2
‑
脱氧
‑
D
‑
核糖
‑5‑
磷酸醛缩酶的溶液加入硅藻土进行吸附、固定。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述含有2
‑
脱氧
‑
D
‑
核糖
‑5‑
磷酸醛缩酶的溶液蛋白浓度为5～50mg/ml，每1ml溶液中加入20～200mg硅藻土。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述含有2
‑
脱氧
‑
D
‑
核糖
‑5‑
磷酸醛缩酶的溶液为pH为4.0～10.0的缓冲液。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述缓冲液的pH为7.0，浓度为0.01mol/L。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述固定时间为1～24h。6.根据权利要求1所述的方法，所述2
‑
脱氧
‑
D
‑
核糖
‑5‑
磷酸醛缩酶来源于细菌、古菌、真菌、环境微生物、不可培养微生物、植物、动物。7.根据权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈依军，张明月，蔡武晋，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：