一种用于中枢神经系统疾病治疗的基因序列构建体技术方案

本发明专利技术提供了一种用于中枢神经系统疾病治疗的基因序列构建体，通过自加工(auto

【技术实现步骤摘要】
一种用于中枢神经系统疾病治疗的基因序列构建体
[0001]本申请是基于申请日为2018年5月31日，申请号为201810553745.9，专利技术名称为“一种用于中枢神经系统疾病治疗的基因序列构建体”的专利申请的分案申请。


[0002]本专利技术涉及基因治疗领域，具体涉及到一种用于中枢神经系统疾病治疗的基因序列构建体，该基因序列构建体可用于对帕金森病、阿尔茨海默症及其他神经退行性疾病进行预防或者治疗。

技术介绍

[0003]帕金森病(PD)是一种神经退行性疾病，以黑质区多巴胺能神经元丢失为特征，导致中脑多巴胺水平降低而致病。帕金森病影响全球约1％的55岁以上的人群，随着社会步入老年化，患者群体还会持续扩大。帕金森病的常见治疗方法是口服给药多巴胺的前体—左旋多巴，在一定程度上可以缓解症状。然而，随着病情的发展，左旋多巴治疗不尽如人意。
[0004]基因治疗对于帕金森病治疗具有独特优势，通过将多巴胺合成基因靶向递送到纹状体可使多巴胺在纹状体内合成并释放，从而使帕金森病的治疗更为有效。酪氨酸经过酪氨酸羟化酶(TH)催化合成左旋多巴，随后芳香族氨基酸脱羧酶(AADC)将左旋多巴转化为多巴胺。TH需要由四氢生物蝶呤作为辅酶，而四氢生物蝶呤由GTP
‑
环化水解酶1(GCH1)催化合成，因此表达TH、AADC和GCH1可以高效合成多巴胺(Azzouz M等人，2002.J Neurosci.22(23):10302
‑
12.；Jarraya B等人，2009.Sci Transl Med.1(2):2)。
[0005]2014年，基于马传染性贫血病毒(EIAV)的慢病毒载体携带以两个内部核糖体进入位点(IRES)连接三种关键的多巴胺合成酶在I/II期临床试验显示了良好的效果(Palfi S等人，2014.Lancet.383(9923):1138
‑
46.)。然而，这个方法具有多个问题，比如IRES表达三个基因经常导致表达不平衡。因此，Stewart HJ等人将接头肽(linker)取代IRES元件以产生包含多巴胺合成所需的三种酶活性中的两种或更多种的融合蛋白(Stewart HJ等人，2016.Hum Gene Ther Clin Dev.27(3):100
‑
10.)。然而，天然状态下TH、AADC和GCH1三个蛋白是以独立蛋白形式表达，融合蛋白有可能会影响多巴胺合成效率，因此，寻找新的蛋白连接表达方式，选择合适的载体导入至靶细胞，并在其中高效表达，仍是帕金森病治疗中亟待解决的问题。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是针对现有治疗技术的不足，通过自加工(auto
‑
processing)表达载体的构建，表达含有酪氨酸羟化酶(TH)、GTP
‑
环化水解酶I(GCH1)、芳香族氨基酸多巴脱羧酶(AADC)，以及神经系统生长因子等；蛋白间通过自加工单元(auto
‑
processing unit，APU)连接；利用病毒载体将其靶向性导入目的细胞最终可产生高效表达的具有独立功能的酪氨酸羟化酶(TH)、GTP
‑
环化水解酶I(GCH1)及芳香族氨基酸多巴脱羧酶(AADC)等，用于治疗帕金森病。
[0007]本专利技术包括如下内容：一种用于中枢神经系统疾病治疗的基因序列构建体，所述的构建体为通过自加工单元(APU)连接的与治疗中枢神经系统疾病相关的核苷酸序列；
[0008]优选地，所述的用于中枢神经系统疾病治疗的基因序列构建体中的与中枢神经系统疾病相关的核苷酸序列选自于酪氨酸羟化酶(TH)、GTP
‑
环化水解酶I(GCH1)、芳香族氨基酸多巴脱羧酶(AADC)、神经系统生长因子核苷酸序列中的两种或者两种以上；
[0009]所述的核苷酸序列之间至少有两个核苷酸序列之间通过自加工单元(APU)连接；所述的自加工单元(APU)包含N
‑
端自加工结构域和/或C
‑
端自加工结构域；
[0010]优选地，所述的神经系统生长因子包括神经生长因子(NGF)、脑衍生神经营养因子(BDNF)、神经生长因子
‑
3(NT
‑
3)、神经生长因子
‑
4/5(NT
‑
4/5)、神经生长因子
‑
6(NT
‑
6)、睫状神经营养因子(CNTF)、胶质细胞系衍生神经营养因子(GDNF)和GDNF分子家族(GDNF的天然存在的类似物、神经秩蛋白、persephin和artemin)；
[0011]优选地，所述的用于中枢神经系统疾病治疗的基因序列构建体包括酪氨酸羟化酶(TH)、GTP
‑
环化水解酶I(GCH1)、芳香族氨基酸多巴脱羧酶(AADC)；
[0012]所述的核苷酸序列之间至少有两个序列之间通过自加工单元(APU)连接；
[0013]优选地，所述的N
‑
端自加工结构域包括Intein、B型细菌体intein样结构域(BIL)、Furin序列，及其衍生物；
[0014]优选地，所述的C
‑
端自加工结构域包括2A肽或类2A肽；
[0015]优选地，所述的用于中枢神经系统疾病治疗的基因序列构建体中的2A肽或类2A肽包括源于口蹄疫病毒的2A肽(F2A)、源于猪捷申病毒的2A肽(P2A)、源于昆虫病毒的2A肽(T2A)，以及源于马鼻炎病毒的2A肽(E2A)。
[0016]自加工2A肽最早源于口蹄疫病毒(FMDV)。FMDV属于小RNA病毒科口蹄疫病毒属。FMDV基因组编码的蛋白酶2A可在翻译过程中形成的高级结构对核糖体肽基转移酶中心造成空间位阻，导致无法形成正常的肽链连接，但同时核糖体却能继续翻译下游蛋白，从而形成一种类似蛋白水解酶的作用将前后两个蛋白顺式“切开”；与FMDV类似，微小核糖核酸病毒科中的心病毒、蒂勒氏鼠脑脊髓病毒、马鼻炎病毒、猪捷申病毒等也含有一2A肽段；此外，在昆虫病毒、C型轮状病毒及锥虫型重复序列中都发现具有2A肽功能类似的基因序列。2A肽或类2A肽自我加工序列与内部核糖体进入位点(IRES)一样都常被应用于多基因表达，以达到独立表达两个及以上非融合外源蛋白的目的；与IRES相比，2A肽或类2A肽在多基因表达载体构建上有明显的优势，比如，2A肽或类2A肽比较小，且2A元件所连接的上下游基因的表达平衡性好；本专利技术使用自加工肽P2A来连接TH、AADC和GCH1三个蛋白，以获得三个蛋白独立高效的表达。
[0017]一种病毒载体基因组，所述的病毒载体基因组包括上述任一所述的用于中枢神经系统疾病治疗的基因序列构建体；
[0018]所述的病毒载体包括慢病毒载体或腺相关病毒载体。
[0019]一种慢病毒载体系统，所述的慢病毒载体系统包括包含有上述的用于中枢神经系统疾病治疗的基因序列构建体的基因组，以及编码gag和po本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基因序列构建体，其特征在于：所述构建体包含通过自加工单元(APU)连接的与治疗中枢神经系统疾病相关的核苷酸序列，其中所述与治疗中枢神经系统疾病相关的核苷酸序列包含编码酪氨酸羟化酶(TH)、GTP
‑
环化水解酶I(GCH1)、或芳香族氨基酸脱羧酶(AADC)中的两种或多种的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的基因序列构建体，其特征在于：所述自加工单元(APU)包含C
‑
端自加工结构域。3.根据权利要求2所述的基因序列构建体，其特征在于：所述C
‑
端自加工结构域包含2A肽或类2A肽。4.根据权利要求3所述的基因序列构建体，其特征在于：所述2A肽或类2A肽包含源于口蹄疫病毒的2A肽(F2A)、源于猪捷申病毒的2A肽(P2A)、源于昆虫病毒的2A肽(T2A)、或源于马鼻炎病毒的2A肽(E2A)。5.根据权利要求4所述的基因序列构建体，其特征在于：所述构建体包含编码酪氨酸羟化酶(TH)、GTP
‑
环化水解酶I(GCH1)、和芳香族氨基酸脱羧酶(AADC)的核苷酸序列；其中所述核苷酸序列的至少两个通过自加工单元(APU)连接。6.根据权利要求5所述的基因序列构建体，其特征在于：所述核苷酸序列的三个通过自加工单元(APU)连接。7.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴昊泉，
申请(专利权)人：康霖生物科技杭州有限公司，
类型：发明
国别省市：