用于筛选干细胞衍生的β样细胞的体外群体的方法及其新型标志物技术

本发明专利技术涉及在多能干细胞衍生细胞的体外细胞群体中筛选β样细胞的方法，其中该方法包括鉴定表达特异性标志物或其组合的β样细胞的步骤，以在移植前预测所述细胞的体内功能性。本发明专利技术还涉及多能干细胞衍生的β样细胞的体外群体，其中所述β样细胞包含一种或多种在天然人β细胞中不存在的标志物，或者所述标志物的表达水平与天然人β细胞中不同。物的表达水平与天然人β细胞中不同。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于筛选干细胞衍生的
β
样细胞的体外群体的方法及其新型标志物


[0001]本专利技术涉及通过鉴定表达一种或多种特异性标志物的β样细胞而在多能干细胞衍生细胞的体外群体中筛选β样细胞的方法。本专利技术还涉及多能干细胞衍生细胞的体外群体，其包含表达特异性标志物的β样细胞，一种或多种标志物在天然人β细胞中不存在或具有与天然人β细胞中不同的表达水平。

技术介绍

[0002]1型糖尿病患者可以通过移植来自人类供体的胰岛进行治疗，一些患者实现了胰岛素非依赖性。然而，供体胰岛稀缺且质量参差不齐，因此，多能干细胞衍生的β样细胞提供了有吸引力的胰岛替代物。
[0003]在体外分化过程中，使用多种化学和生物因素使人多能干细胞进行分化，以产生包含不同内分泌细胞类型的异质胰岛样细胞簇。
[0004]经典的β细胞标志物包括胰岛素(INS)和典型的转录因子，如PDX1和NKX6.1。传统上，这些标志物用于鉴定干细胞衍生的β样细胞。尽管所有干细胞衍生的β样细胞可能通过体外经典β细胞标志物的表达而在表型上看起来与天然人β细胞相似，但它们是不同的，因为并非所有干细胞衍生的β样细胞在移植后都表达和分泌胰岛素。经典的β细胞标志物不足以在体外鉴定移植后维持胰岛素表达和分泌的干细胞衍生的β样细胞。一些经典的β细胞标志物如PDX1甚至与体内功能呈负相关，导致干细胞向β样细胞的体外分化方案朝不希望的细胞群体优化，或选择出在移植前可能类似于天然人β细胞的表型但在移植后改变其表型的细胞群体。
[0005]鉴定在移植后维持胰岛素表达和分泌的干细胞衍生β样细胞的体外群体对于分化的β样细胞产品性能、评估和生产至关重要。因此，需要鉴定新的标志物，所述标志物定义在移植后维持胰岛素表达和分泌的干细胞衍生的β样细胞的体外群体。

技术实现思路

[0006]在一方面，本专利技术涉及在多能干细胞衍生细胞的体外群体中筛选β样细胞的方法，其中所述方法包括鉴定β样细胞的步骤，所述β样细胞表达NKX6.1与一种或多种选自ACVR1C、FREM2、CHRNA3、DCC、SOX11、MARCKSL1、BASP1、STARD10、AMBP、ST6GALNAC5、HMGCS1、ELAVL2、PCP4、PCDH7、NEFL、PLAGL1、EGFL7、RAD21、RTN1、PLXNA2、LBH、NEFM、SLC30A8、DLK1、MAFB和ISL1的标志物的组合。
[0007]在一方面，本专利技术涉及多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中至少55％的所述β样细胞包含一种或多种选自SOX11、FREM2、DCC、BASP1、CHRNA3和ELALV2的标志物，其中所述标志物在天然人β细胞中不存在。
[0008]在一方面，本专利技术涉及多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中至少80％的所述β样细胞包含一种或多种选自ACVR1C、MARCKSL1、STARD10、AMBP、ST6GALNAC5和HMGCS1的标志
物，其中所述标志物的表达水平比所述标志物在天然人β细胞中的表达至少高约1个平均对数倍数变化。
[0009]在一方面，本专利技术涉及包含β样细胞的多能干细胞衍生细胞的体外群体，其用于治疗1型糖尿病。
[0010]在一方面，本专利技术涉及细胞组合物，其包含多能干细胞衍生细胞的体外群体和细胞培养基，所述体外群体包含通过本专利技术获得的β样细胞。
[0011]在一方面，本专利技术涉及可植入装置，其包含多能干细胞衍生细胞的体外群体，所述体外群体包含通过本专利技术获得的β样细胞。
[0012]在一方面，本专利技术涉及治疗1型糖尿病的方法，其包括向有需要的人施用包含通过本专利技术获得的β样细胞的多能干细胞衍生细胞的体外群体。
[0013]在一方面，本专利技术涉及冷冻保存的多能干细胞衍生细胞的体外群体，其包含通过本专利技术获得的β样细胞。
[0014]在一方面，本专利技术提供了移植前的多能干细胞的体外群体，其包含β样细胞或胰岛素产生细胞。
[0015]本专利技术还可以解决从示例性实施方案的公开内容中将会明显看出的其他问题。
附图说明
[0016]图1A的图形显示了从八种不同的(修改的)用于获得干细胞衍生细胞的方案以及从尸体人胰岛细胞采样的所有细胞的T分布随机近邻嵌入(tSNE)投影。
[0017]图1B的图形显示了26个细胞簇的tSNE投影，其中每个簇由具有相似基因表达谱的细胞组成。
[0018]图2的图形在X轴上显示了干细胞衍生簇编号，并在Y轴上显示了β细胞评分。其表明，基于所有细胞的人β细胞基因模块评分，编号为14、15和26的干细胞衍生的β样细胞簇与编号为16的天然人β细胞簇非常相似。
[0019]图3的图形在X轴上显示了天然胰岛亚型，并在Y轴上显示了β细胞评分。所有在β细胞基因集上评分高的细胞都被归类为天然人β细胞。
[0020]图4的图形显示了干细胞衍生的β样细胞的体外群体所特有的基因表达谱。将天然人β细胞(簇16)与干细胞衍生的β样细胞(簇14、15和26)进行比较。天然人β细胞的UPT中值(衡量RNA质量的指标)等于0。干细胞衍生的β样细胞的UPT中值大于天然人β细胞。这些图使用箱形图显示了原代或天然人β细胞与干细胞衍生的β样细胞之间的平均表达差异，并使用单点显示了在各个细胞中的表达。每列下方给出了显示不表达的细胞的百分比。
[0021]图5的图片显示了体内移植前后的干细胞衍生细胞。其表明一些干细胞衍生细胞在体内暴露后不会保持胰岛素阳性。移植前后干细胞衍生细胞的NKX6.1、胰岛素和胰高血糖素染色表明，尽管这些细胞在移植前看起来与天然人β细胞相似，但移植后在胰岛素表达和分泌上存在显著差异。
[0022]图6的图形在X轴上显示了簇14、15和26中的细胞百分比，并在Y轴上显示了移植后8周的平均人C
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肽。其显示干细胞衍生的β样细胞与体内暴露后8周分泌的人C
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肽之间呈正相关。在移植了使用不同(修改的)分化方案生成的细胞的SCID
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beige动物中测得的C
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肽水平显示与簇14、15和26的累积大小呈正相关。
[0023]图7的图形显示，经典β细胞标志物NKX6.1、SYT13、NKX2.2、PDX1、PDX1+/NKX6.1+、PAX4与SCID小鼠中移植后8周的平均人C
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肽呈负相关。
[0024]图8a)的上图是显示SLC30A8在干细胞衍生的β样细胞群体中富集的图形。
[0025]图8a)的下图是显示PDX1的广泛表达的图形。
[0026]图8b)的上图是显示SLC30A8与SCID小鼠中移植后8周的平均人C
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肽呈正相关的图形。
[0027]图8b)的下图是显示PDX1与SCID小鼠中移植后8周的平均人C
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肽呈负相关的图形。
[0028]图9a)显示ACVR1C在天然人β细胞中不表达。
[0029]图9b)显示ACVR1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.在多能干细胞衍生细胞的体外群体中筛选β样细胞的方法，其中所述方法包括鉴定β样细胞的步骤，所述β样细胞表达NKX6.1与一种或多种选自ACVR1C、FREM2、CHRNA3、DCC、SOX11、MARCKSL1、BASP1、STARD10、AMBP、ST6GALNAC5、HMGCS1、ELAVL2、PCP4、PCDH7、NEFL、PLAGL1、EGFL7、RAD21、RTN1、PLXNA2、LBH、NEFM、SLC30A8、DLK1、MAFB和ISL1的标志物的组合。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述β样细胞通过RNAseq进行筛选。3.多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中所述群体包含至少15％的如下β样细胞，所述β样细胞表达NKX6.1与一种或多种选自ACVR1C、FREM2、CHRNA3、DCC、SOX11、MARCKSL1、BASP1、STARD10、AMBP、ST6GALNAC5、HMGCS1、ELAVL2、PCP4、PCDH7、NEFL、PLAGL1、EGFL7、RAD21、RTN1、PLXNA2、LBH、NEFM、SLC30A8、DLK1、MAFB和ISL1的标志物的组合，并且其中所述β样细胞在移植后维持胰岛素表达和分泌。4.根据权利要求3所述的多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中至少55％的所述β样细胞表达一种或多种选自SOX11、FREM2、DCC、BASP1、CHRNA3和ELALV2的标志物，其中所述标志物在天然人β细胞中不存在。5.根据权利要求3所述的多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中至少80％的所述β样细胞表达一...

【专利技术属性】
技术研发人员：J，
申请(专利权)人：诺和诺德股份有限公司，
类型：发明
国别省市：