一种口蹄疫灭活疫苗中3AB和/或3ABC非结构蛋白定量检测试剂盒和应用制造技术

本发明专利技术提供了一种口蹄疫灭活疫苗中3AB和/或3ABC非结构蛋白定量检测试剂盒和应用，属于疫苗检测技术领域。本发明专利技术基于双抗体夹心ELISA原理和生物素

【技术实现步骤摘要】
一种口蹄疫灭活疫苗中3AB和/或3ABC非结构蛋白定量检测试剂盒和应用


[0001]本专利技术属于疫苗检测
，具体涉及一种口蹄疫灭活疫苗中3AB和/或3ABC非结构蛋白定量检测试剂盒和应用。

技术介绍

[0002]口蹄疫(Foot
‑
and
‑
mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒(Foot
‑
and
‑
mouth disease virus，FMDV)引起的偶蹄动物共患的一种急性、热性、高度接触性传染病。该病传播迅速，可形成世界性大流行，造成巨大政治、经济损失。世界各国都高度重视该病的预防与控制，在我国主要采取免疫接种的手段预防口蹄疫的发生，如何区分疫苗免疫动物与自然感染动物，进行感染状况的评估以及净化检疫是该病防控的主要内容。利用非结构蛋白(NSPs)抗体检测可有效区分疫苗免疫动物与自然感染动物，但如果疫苗抗原纯化工艺不过关，灭活疫苗抗原中仍然会有少量非结构蛋白(NSP)残留，多次免疫后会造成NSPs抗体的阳转，影响免疫背景下感染状况的评估以及净化检疫。双抗体夹心ELISA方法是一种简便、灵敏、特异的检测方法，已广泛应用于多种疫苗的质量控制。然而目前还没有关于用于检测防控口蹄疫灭活疫苗中非结构蛋白的试剂盒。

技术实现思路

[0003]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种口蹄疫灭活疫苗中3AB和/或3ABC非结构蛋白定量检测试剂盒，具有检测快速且检测灵敏度高的特点。
[0004]本专利技术提供了一种口蹄疫灭活疫苗中3AB和/或3ABC非结构蛋白定量检测试剂盒，包括包被有3A单克隆抗体的酶标板、生物素标记3B单克隆抗体和酶标亲和素。
[0005]优选的，所述包被有3A单克隆抗体的酶标板中3A单克隆抗体的包被浓度为0.5～4μg/mL；
[0006]所述3A单克隆抗体是由4E3A9细胞株分泌得到；
[0007]所述生物素标记3B单克隆抗体中3B单克隆抗体是由3B4B1细胞株分泌得到。
[0008]优选的，所述包被有3A单克隆抗体的酶标板的制备方法，用包被液将3A单克隆抗体稀释后加入酶标板中，3～5℃下包被16～20h，封闭，干燥，得到包被有3A单克隆抗体的酶标板。
[0009]优选的，所述包被液为0.04～0.06mol/L、pH值9.6碳酸盐缓冲液。
[0010]优选的，所述封闭用溶液为含质量浓度0.8％～1.2％BSA和质量浓度4％～6％蔗糖、pH值为7.4的PBS溶液。
[0011]优选的，所述检测试剂盒还包括以下一种或几种组分：抗原标准品、样品稀释液、洗涤液、底物溶液和终止液。
[0012]本专利技术提供了所述检测试剂盒在检测口蹄疫灭活疫苗中3AB和/或3ABC蛋白中的应用。
[0013]本专利技术提供了一种基于所述检测试剂盒的检测口蹄疫灭活疫苗抗原纯净度的方法，包括以下步骤：
[0014]1)将待检样品加入到包被有3A单克隆抗体的酶标板中，加入生物素标记3B单克隆抗体工作液，孵育，去除试剂，洗涤；
[0015]2)向步骤1)中洗涤后的酶标板中加入酶标亲和素工作液，孵育，洗涤；
[0016]3)将步骤2)中洗涤后的酶标板中加入底物溶液，孵育，去除底物溶液；
[0017]4)将步骤3)中去除底物溶液的酶标板加入终止液，检测酶标板的吸光值；
[0018]5)利用标准品绘制标准曲线，根据标准曲线回归分析计算待测样本中3AB和/或3ABC蛋白的含量；
[0019]6)根据待测样本中3AB和/或3ABC蛋白的含量判断灭活疫苗抗原纯净度：待测样本中3AB和/或3ABC蛋白含量≤5ng/ml，待测样本的疫苗抗原纯净度合格，否则待测疫苗抗原纯净度不合格。
[0020]优选的，所述生物素标记3B单克隆抗体工作液的浓度为25～200ng/mL；
[0021]所述酶标亲和素工作液的浓度为20～50ng/mL。
[0022]优选的，所述检测试剂盒对3AB和/或3ABC蛋白含量的检测范围为2.5～160ng/mL。
[0023]本专利技术提供了一种口蹄疫灭活疫苗中3AB和/或3ABC非结构蛋白定量检测试剂盒，是基于双抗体夹心ELISA原理和生物素
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亲和素检测系统制备得到，其中包被抗体用口蹄疫病毒非结构蛋白3A单克隆抗体，检测抗体用生物素标记3B单克隆抗体。本专利技术提供的试剂盒具有检测灵敏度高的特点，对3AB和3ABC两种非结构蛋白的检测限分别为2.5ng/ml。以原核表达并纯化的3AB蛋白作为标准品建立标准曲线，所述试剂盒的检测范围为2.5～160ng/ml。本专利技术提供的试剂盒还具有检测时间短，操作简便，重复性高的特点，为口蹄疫灭活疫苗中3AB与3ABC非结构蛋白定量检测与疫苗抗原纯净度合格判定提供了有效工具，也为口蹄疫疫苗生产企业在进行抗原纯化以及疫苗抗原纯净度检测提供了新思路。
附图说明
[0024]图1为3AB蛋白表达和纯化的SDS
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PAGE分析图；
[0025]图2为3AB蛋白定量检测的标准曲线与回归分析；
[0026]图3为3ABC B
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ELISA检测标准抗原定量免疫牛结果分析图。
具体实施方式
[0027]本专利技术提供了一种口蹄疫灭活疫苗中3AB和/或3ABC非结构蛋白定量检测试剂盒，包括包被有3A单克隆抗体的酶标板、生物素标记3B单克隆抗体和酶标亲和素。
[0028]在本专利技术中，所述包被有3A单克隆抗体的酶标板中3A单克隆抗体的包被浓度优选为0.5～4μg/mL更优选为1～3μg/mL，最优选为2μg/mL。所述包被有3A单克隆抗体的酶标板的制备方法，优选用包被液将3A单克隆抗体稀释后加入酶标板中，3～5℃下包被16～20h，封闭，干燥，得到包被有3A单克隆抗体的酶标板。所述包被液优选为0.04～0.06mol/L、pH值9.6碳酸盐缓冲液，更优选为0.05mol/L、pH值9.6碳酸盐缓冲液。3A单克隆抗体稀释液的添加体积优选为100μL/孔。所述包被优选为在4℃下包被18h。所述封闭用溶液优选为含质量浓度0.8％～1.2％BSA和质量浓度4％～6％蔗糖、pH值为7.4的PBS溶液，更优选为含质量浓
度1％BSA和质量浓度5％蔗糖、pH值为7.4的PBS溶液。所述封闭的时间优选为45～65min，更优选为60min。所述封闭的温度优选为36～38℃，更优选为37℃。所述3A单克隆抗体是由4E3A9细胞株分泌得到；
[0029]在本专利技术中，所述生物素标记3B单克隆抗体中3B单克隆抗体是由3B4B1细胞株分泌得到，具体参见现有技术(:FuY,Lu Z,Li P,Cao Y,Sun P,et al.(2014)Development of a Blocking ELISA Based on a Monoclonal Antibody against a Predominant Epitope 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种口蹄疫灭活疫苗中3AB和/或3ABC非结构蛋白定量检测试剂盒，其特征在于，包括包被有3A单克隆抗体的酶标板、生物素标记3B单克隆抗体和酶标亲和素。2.根据权利要求1所述检测试剂盒，其特征在于，所述包被有3A单克隆抗体的酶标板中3A单克隆抗体的包被浓度为0.5～4μg/mL；所述3A单克隆抗体是由4E3A9细胞株分泌得到；所述生物素标记3B单克隆抗体中3B单克隆抗体是由3B4B1细胞株分泌得到。3.根据权利要求2所述检测试剂盒，其特征在于，所述包被有3A单克隆抗体的酶标板的制备方法，用包被液将3A单克隆抗体稀释后加入酶标板中，3～5℃下包被16～20h，封闭，干燥，得到包被有3A单克隆抗体的酶标板。4.根据权利要求3所述检测试剂盒，其特征在于，所述包被液为0.04～0.06mol/L、pH值9.6碳酸盐缓冲液。5.根据权利要求3所述检测试剂盒，其特征在于，所述封闭用溶液为含质量浓度0.8％～1.2％BSA和质量浓度4％～6％蔗糖、pH值为7.4的PBS溶液。6.根据权利要求1～5任意一项所述检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括以下一种或几种组分：抗原标准品、样品稀释液、洗涤液、底物溶液和终止液。7.权利要求1～6任意一项所述检测试剂盒在检测口蹄疫灭活疫苗中3...

【专利技术属性】
技术研发人员：付元芳，卢曾军，孙普，曹轶梅，李冬，白兴文，李坤，包慧芳，赵志荀，李平花，王健，马雪青，张婧，袁红，张强，刘在新，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：