一种分子开关及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种分子开关及其应用，所述分子开关包括适配体序列、第一线性链和第二线性链，所述适配体序列能够结合待测蛋白，且所述适配体序列在3'末端包括阻遏基团；所述第一线性链从5

【技术实现步骤摘要】
一种分子开关及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
具体来说，涉及一种分子开关及其应用。

技术介绍

[0002]生物标志物包括一大类分子指标，例如核酸分子、蛋白、多糖或者脂质分子等。它们可以客观地反映一些医学指标，并且可以在病人体外精确检测，且具有很好的可重复性1。近年来，由于转录组学和蛋白质组学的快速发展，越来越多的疾病相关生物标志物被发现，并在疾病的早期筛查和预后检测中发挥着重要作用
2,3
。相较于传统医学诊断工具(如MRI)需要先进的设备，在许多情况下，生物标志物检测只需要简单的仪器，即使非专业人员也可以操作。这在新冠病毒检测中就有很多应用4。
[0003]在众多生物标志物中，蛋白质占很大比例。例如肿瘤免疫和微环境生物标志物PD1、PDL1、VEGF，基因变异生物标志物(genetic variant biomarkers)FEGR1(成纤维细胞生长因子受体1)、DDR2(盘状结构域受体酪氨酸激酶2)、上皮
‑
间充质转化相关生物标志物TGFβ5。当前针对蛋白质类型的生物标志物的检测方法，包括质谱(MS)、磁共振成像(MRI)、酶联免疫分析(ELISA)、Western blot、免疫组化染色(IHC)、流式荧光杂交法(xMAP)6等。如表1所示，这些方法在实际应用中或多或少存在一些问题。最核心的问题在于时间长、检测精度低和成本高。
[0004]表1：蛋白质检测方法的局限性
[0005][0006]因此，需要一种时间短、检测精度高和成本低的蛋白质检测方法。

技术实现思路

[0007]本专利技术设计了由两条DNA单链和适配体组成的分子开关，利用重组酶聚合酶反应放大信号，通过荧光探针进行实时信号检测，实现了对靶蛋白(也可以称为待测蛋白)的快速高灵敏度的检测。更换适配体序列、更换模板序列而不改动总的分子开关设计、更换核酸的修饰基团种类而不改变其目的、更换探针的种类、更换常温恒温扩增体系等不影响核心反应原理的设计均应属于本专利技术保护的范畴。
[0008]具体来说，本专利技术提供以下技术方案：
[0009]一方面，本专利技术提供了一种分子开关，所述分子开关包括适配体序列、第一线性链和第二线性链，其特征在于：
[0010]所述适配体序列能够结合待测蛋白，且所述适配体序列在3'末端包括阻遏基团；
[0011]所述第一线性链从5
’
端开始顺次包括第一序列、第二序列和第三序列，所述第一序列包括第二引物序列，所述第二序列和所述第三序列与所述适配体序列和所述第二线性链互补，所述第二引物序列用于在所述分子开关开启后，DNA聚合酶以所述第一线性链为模板延伸所述第二线性链时，在所述第二线性链上产生第二引物的结合位点，从而所述第二引物能够以所述第二线性链为模板进行复制；
[0012]所述第二线性链的3
’
端与所述适配体序列紧靠，且所述第二线性链从5
’
端开始顺次包括第四序列、第五序列和第六序列，所述第四序列和第六序列分别与所述第三序列和第二序列互补，所述第五序列形成开口环，所述开口环中包括第一引物序列和探针序列，所述第一引物序列和所述探针序列用于在所述第二引物以所述第二线性链为模板进行复制，所述开口环被打开成为线性链时，在所述第二线性链的互补序列中产生所述第一引物和所述探针的结合位点，从而所述第一引物能够以所述第二线性链的互补链为模板进行复制，进一步产生所述探针的结合位点。
[0013]在一些实施方案中，所述阻遏基团选自磷酸基团、C3
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Spacer和胺基。
[0014]在一些实施方案中，所述适配体序列与待测蛋白结合，离开所述第二链，所述分子开关开启。
[0015]在一些实施方案中，所述探针序列包括核酸外切酶的识别位点、荧光基团、淬灭基团和修饰基团。
[0016]在一些实施方案中，所述荧光基团和淬灭基团位于所述核酸外切酶的识别位点的两侧。
[0017]在一些实施方案中，所述荧光基团和淬灭基团的间距为2
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4nt。
[0018]在一些实施方案中，所述修饰基团位于所述探针序列的3
’
末端。
[0019]在一些实施方案中，所述修饰基团用于阻断DNA聚合酶，且所述修饰基团选自胺基、磷酸基团和C3
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spacer。
[0020]在一些实施方案中，在所述第二线性链中，所述第四序列不进行扩增。
[0021]在一些实施方案中，所述适配体序列如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:17所示。
[0022]在一些实施方案中，所述第一线性链的序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:11所示。
[0023]在一些实施方案中，所述第二线性链的序列如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:14所示。
[0024]在一些实施方案中，所述探针的序列如SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:18所示。
[0025]在一些实施方案中，所述第一引物的序列如SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:19所示。
[0026]在一些实施方案中，所述第二引物的序列如SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:20所示。
[0027]另一方面，本专利技术提供蛋白质的检测方法，其特征在于所述方法利用上述的分子开关和重组酶聚合酶反应进行。
[0028]另一方面，本专利技术提供上述分子开关在蛋白质检测中的应用。
[0029]定义
[0030]不对称PCR方法：利用不等量的一对引物来产生大量单链DNA(ssDNA)的方法。可分为引物浓度不对称PCR和热不对称PCR。这两种引物分别称为限制性引物与非限制性引物，
关键是限制性引物的绝对量。限制性引物太多太少，均不利于制备ssDNA。也可用普通PCR制备靶DNA双链DNA(dsDNA)，再以dsDNA为模板，只用其中一种过量引物进行单引物PCR制备ssDNA。
[0031]Phanta Max聚合酶：一种高保真的DNA聚合酶。本专利技术对DNA聚合酶无特殊要求，可以使用任意高保真短片段DNA聚合酶。
[0032]N蛋白：新冠病毒有四种主要的结构蛋白：刺突蛋白(S蛋白)、核衣壳蛋白(N蛋白)、膜蛋白(M蛋白)、包膜蛋白(E蛋白)。S蛋白是冠状病毒非常重要的表面蛋白，与病毒的传染能力密切相关，S蛋白包含S1、S2和受体结合域(RBD)。N蛋白在冠状病毒中含量丰富，是一种高度免疫原性蛋白，参与基因组复制和细胞信号通路调节。S蛋白和N蛋白是新冠免疫检测试剂盒关键原材料，对新冠病毒的诊断和排查具有重要价值。
[0033]Tau蛋白：Tau蛋白是神经纤维缠结的主要组分，也是阿尔茨海默症(AD)等一系列神经退行性疾病的标志物。
[0034]RPA反应：即重组酶聚合酶反应，是在由多种酶和蛋白的参与下，在恒温条件下实现核酸指数扩增的技术，被称为是可以替代PCR的核酸检测技术。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.分子开关，所述分子开关包括适配体序列、第一线性链和第二线性链，其特征在于：所述适配体序列能够结合待测蛋白，且所述适配体序列在3'末端包括阻遏基团；所述第一线性链从5
’
端开始顺次包括第一序列、第二序列和第三序列，所述第一序列包括第二引物序列，所述第二序列和所述第三序列与所述适配体序列和所述第二线性链互补，所述第二引物序列用于在所述分子开关开启后，DNA聚合酶以所述第一线性链为模板延伸所述第二线性链时，在所述第二线性链上产生第二引物的结合位点，从而所述第二引物能够以所述第二线性链为模板进行复制；所述第二线性链的3
’
端与所述适配体序列紧靠，且所述第二线性链从5
’
端开始顺次包括第四序列、第五序列和第六序列，所述第四序列和第六序列分别与所述第三序列和第二序列互补，所述第五序列形成开口环，所述开口环中包括第一引物序列和探针序列，所述第一引物序列和所述探针序列用于在所述第二引物以所述第二线性链为模板进行复制，所述开口环被打开成为线性链时，在所述第二线性链的互补序列中产生所述第一引物和所述探针的结合位点，从而所述第一引物能够以所述第二线性链的互补链为模板进行复制，进一...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹耀中，许广韬，李迈，洪泂，夏姝严，吴笑渔，施珂玥，薛睿豪，王涵，叶润东，韩子骏，
申请(专利权)人：中国科学技术大学，
类型：发明
国别省市：