生产β-丙氨酸的重组基因工程菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了三种生产β

【技术实现步骤摘要】
生产
β
‑
丙氨酸的重组基因工程菌及其应用


[0001]本专利技术涉及生产β
‑
丙氨酸的重组基因工程菌领域，具体涉及三种生产β
‑
丙氨酸的重组基因工程菌及其应用。

技术介绍

[0002]β
‑
丙氨酸，又名3
‑
氨基丙酸，是天然存在的唯一一种β型非蛋白氨基酸，是生物体内合成D
‑
泛酸和辅酶A的重要前体，对于维持细胞生长起到重要的生理作用。作为一种重要的3碳平台化合物，β
‑
丙氨酸被广泛应用于食品、饲料添加剂、精细化学品和制药等领域，是12种最具潜力的三碳化工产品之一。在医药领域中，β
‑
丙氨酸主要用于合成泛酸以及泛酸钙，是酰基载体蛋白(ACP)和辅酶A(CoA)的前体，而其在帮助细胞再生、协助中枢神经系统正常发育过程和参与蛋白质、脂肪、糖在体内的新陈代谢中起到重要的生理功能。此外，β
‑
丙氨酸还可以作为维生素B5、巴柳氮和肌肽等药物的原材料。在食品领域，β
‑
丙氨酸不仅可以作为一种食品添加剂改善食品味道，还可作为运动员营养补充剂，改善身体机能。在精细化工领域，β
‑
丙氨酸可用于制备药剂中的沉淀剂，电镀缓蚀剂及铅中毒解毒剂等。此外，它还可以直接用于生产聚β
‑
丙氨酸，广泛应用于化妆品、水净化和建筑等领域。
[0003]目前国内外生产β
‑
丙氨酸的主要有以下3种方法：化学合成法，即利用丙烯腈、丙烯酸和β
‑
氨基丙腈等腈类物质通过高压高温，在强酸强碱的条件下合成β
‑
丙氨酸。但是化学合成法能耗大，对设备要求高，并且在生产过程中产生对环境和人体有害的物质，同时产生的副产物会对随后的分离和纯化带来较大困难；生物酶催化法，以天冬氨酸为底物，利用枯草芽孢杆菌或者谷氨酸棒状杆菌等菌株来源的天冬氨酸脱羧酶在大肠杆菌中表达催化β
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丙氨酸的生成。此方法条件更加温和、安全和污染少，引起更多学者的关注；微生物发酵法生产β
‑
丙氨酸，微生物发酵法是利用合成生物学、系统代谢工程、蛋白质工程以及转录组和代谢组等技术，改造目标产物β
‑
丙氨酸的代谢过程，使更多的代谢流流向目的产物的方向。随着气候变化和环境问题日益严峻，利用廉价葡萄糖等为碳源，探索清洁环保低能耗的生产方法引起众多学者的关注。
[0004]随着对微生物代谢过程的不断了解，以及代谢改造技术(系统代谢工程、合成生物学、启动子工程、蛋白质工程及转录组和代谢组)的不断发展，利用廉价葡萄糖等为碳源来生产包括β
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丙氨酸在内的多种高附加值产物具备广阔的生产应用前景。然而，由于野生型大肠杆菌本身生理特性，在大肠杆菌细胞中合成的β
‑
丙氨酸只能满足自身生长所需，不会大量积累，所以必须对β
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丙氨酸的合成途径理性改造，构建稳定高效的细胞工厂。高产β
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丙氨酸的菌株可以由基因工程和代谢工程等策略获得。但是在基因工程菌构建的过程中需要考虑到不同代谢途径之间关联，在提高目的产物代谢通量的同时不能影响细胞的正常生长，所以需要从多个角度出发进行理性代谢工程改造。
[0005]在大肠杆菌中β
‑
丙氨酸的从头合成途径包括了葡萄糖摄取，糖酵解途径，TCA循环，L
‑
天冬氨酸合成及其β
‑
丙氨酸合成途径。首先是葡萄糖在PTS或者非PTS系统下完成葡萄糖的磷酸化从而合成葡萄糖
‑6‑
磷酸，碳流量进入糖酵解途径，在糖酵解途径中合成β
‑
丙
氨酸的前体物磷酸烯醇式丙酮酸，在磷酸烯醇丙酮酸羧化酶催化作用在磷酸烯醇式丙酮酸生产草酰乙酸，其中草酰乙酸不稳定易分解，在天冬氨酸转氨酶催化下生成天冬氨酸，随后在天冬氨酸脱羧酶催下生成β
‑
丙氨酸。其中L
‑
赖氨酸，L
‑
苏氨酸，O
‑
琥珀酰高丝氨酸和高丝氨酸同属于天冬氨酸族氨基酸，它们和β
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丙氨酸拥有共同的前体L
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天冬氨酸，所以削弱竞争支路是一种有效的构建策略。但是还需要深入探究影响β
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丙氨酸产量的瓶颈。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是利用代谢工程和基因编辑技术构建三种生产β
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丙氨酸的重组基因工程菌以及该工程菌在微生物发酵制备β
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丙氨酸中的应用，克服了化学法生产β
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丙氨酸高耗能、高污染的缺陷；也克服了生物酶法生产β
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丙氨酸高成本的缺陷。此专利技术为工业化生产β
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丙氨酸奠定了基础。
[0007]本专利技术采用的技术方案：
[0008]大肠杆菌A1：替换panD基因为含有Trc启动子的枯草芽孢杆菌的panD基因，含有Trc启动子的ppc、glk、gltBD基因，敲除ptsG、galR、cycA、iclR基因，替换起始密码子ATG为GTG的lysC基因和thrA基因，以及导入含有枯草芽孢杆菌的panD基因和谷氨酸棒状杆菌的aspB基因的pTrc99a质粒。
[0009]大肠杆菌B1：含有Trc启动子的panD、ppc基因，敲除pykA、cycA基因，以及导入含枯草芽孢杆菌的panD基因和谷氨酸棒状杆菌的aspA、aspB基因的pTrc99a质粒的大肠杆菌，其中panD基因104号位点赖氨酸突变为丝氨酸。
[0010]大肠杆菌C1：为含有Trc启动子的ppc、panD、glK基因，敲除pykA、aspA、pykF基因，以及导入含枯草芽孢杆菌的panD基因的pTrc99a质粒的大肠杆菌。
[0011]大肠杆菌A1：E.coli W3110TrcpanD
(bs)
::panDTrcppcΔptsGTrcglkΔgalRΔcycAΔiclRlysC*thrA*Trcglt BD/pTrc99a
‑
panD
(bs)
‑
aspB
(cg)
构建参照Wang,P.,Zhou,H.Y.,Li,B.,Ding,W.Q.,Liu,Z.Q.,Zheng,Y.G.,2021.Multiplex modification of Escherichia coli for enhancedβ
‑
alanine biosynthesis through metabolic engineering.
[0012]大肠杆菌B1：E.coliW3110TrcpanDTrcppcΔpykAΔcycA/pTrc99a
‑
panD
(bs)K104S
aspAaspB
(cg)
构建参照Li,B.,Zhang,B.,Wan本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.生产β
‑
丙氨酸的重组基因工程菌，其特征在于，包括：重组基因工程菌A2是以大肠杆菌A1为出发菌株，敲除pck基因后构建得到，所述的大肠杆菌A1的基因型为E.coli W3110TrcpanD
(bs)
::panDTrcppcΔptsGTrcglkΔgalRΔcycAΔiclRlysC*thrA*TrcgltBD/pTrc99a
‑
panD
(bs)
‑
aspB
(cg)
；重组基因工程菌B2是以大肠杆菌B1为出发菌株，敲除pck基因后构建得到，所述的大肠杆菌B1的基因型为E.coli W3110TrcpanDTrcppcΔpykAΔcycA/pTrc99a
‑
panD
(bs)K104S
‑
aspA
(cg)
‑
aspB
(cg)
；重组基因工程菌C2是以大肠杆菌C1为出发菌株，敲除pck基因后构建得到，所述大肠杆菌C1为含有Trc启动子的ppc、panD、glK基因，敲除pykA、aspA、pykF基因，以及导入含枯草芽孢杆菌的panD基因的pTrc99a质粒的大肠杆菌。2.如权利要求1所述的生产β
‑
丙氨酸的重组基因工程菌，其特征在于，所述pck基因的核苷酸序列如SEQ ID N...

【专利技术属性】
技术研发人员：柳志强，张义峰，周海岩，丁文清，郑裕国，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：