一种稳定遗传外源基因的粘质沙雷氏菌工程菌及其应用制造技术

本发明专利技术具体涉及一种稳定遗传外源基因的粘质沙雷氏菌工程菌BRC

【技术实现步骤摘要】
一种稳定遗传外源基因的粘质沙雷氏菌工程菌及其应用


[0001]本专利技术属于微生物
，具体涉及一种稳定遗传外源基因的粘质沙雷氏菌工程菌BRC
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CXG2
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pCHSW及其应用。

技术介绍

[0002]松墨天牛、星天牛、云斑天牛、光肩星天牛、红棕象甲、赤拟谷盗等是重要的鞘翅目害虫，对我国许多种类农林植物造成重大危害，研究建立针对上述害虫持久高效的生物防治方法具有重要的生态学和经济学意义。目前已经发现生物杀虫毒素Cry3AaT蛋白对多种鞘翅目害虫具有杀虫活性，但将其应用于生产实践仍然存在一些重要问题。其杀虫机理主要是昆虫取食毒素后，毒素与昆虫肠道上皮细胞表面受体结合形成膜穿孔，从而造成昆虫死亡；而松墨天牛、星天牛、云斑天牛、光肩星天牛、红棕象甲等钻蛀性害虫主要隐蔽在树干中危害，导致该毒素无法直接与进入害虫肠道，进而影响该毒素的应用。因此，筛选获得植物与害虫肠道的共生菌作为毒素载体，通过基因工程构建能够表达分泌毒素的工程菌，是解决这一问题的理想途径。
[0003]粘质沙雷氏菌是一种普遍存在于鞘翅目昆虫肠道和植物组织中的共生菌。该菌能够富集于鞘翅目昆虫肠道并起到降解消化木质素等作用，其本身对昆虫并无致病性。同时，该菌能够在植物体内长期存在，也广泛分布于土壤中，能够长期在自然环境中宿存。将该菌株在鞘翅目昆虫肠道富集的特性与Cry3AaT毒素的杀虫活性相结合，进行工程菌株构建，进而将杀虫毒素蛋白富集于害虫肠道，将有利于极大提高该毒素的应用效能。与此同时，由于传统的工程菌存在质粒易丢失、遗传稳定性低等问题，并且只能在胞内表达杀虫毒素蛋白，无法将蛋白分泌到胞外。因此，构建一株能够稳定遗传外源基因，且能够外分泌毒素蛋白的沙雷氏菌工程菌具有重要的实践意义。

技术实现思路

[0004]针对现有技术存在的不足，本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种稳定遗传外源基因的粘质沙雷氏菌工程菌及其应用。
[0005]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种稳定遗传外源基因的粘质沙雷氏菌工程菌BRC
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CXG2
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pCHSW，所述菌株的分类命名为粘质沙雷氏菌Serratia marcescens，已于2021年8月6 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.23125。
[0006]进一步的，上述粘质沙雷氏菌工程菌BRC
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CXG2
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pCHSW能够稳定遗传nptII
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cry3AaT
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hasA外源基因且能外分泌表达Cry3AaT蛋白。
[0007]一种构建上述粘质沙雷氏菌工程菌的方法，其是通过接合转移技术，将携带能够实现杀虫毒素蛋白外分泌表达的基因nptII
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cry3AaT
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hasA的pCHSW质粒转入粘质沙雷氏菌菌株BRC
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CXG2中，利用质粒上携带的tnp转座基因将外源基因nptII
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cry3AaT
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hasA插入粘
质沙雷氏菌BRC
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CXG2基因组中，从而获得所述粘质沙雷氏菌工程菌BRC
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CXG2
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pCHSW。
[0008]其中，所述pCHSW质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0009]上述一种粘质沙雷氏菌工程菌BRC
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CXG2
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pCHSW在防治鞘翅目害虫中的应用。
[0010]上述一种粘质沙雷氏菌工程菌BRC
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CXG2
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pCHSW在防治鞘翅目害虫后代中的应用。
[0011]其中，上述鞘翅目害虫为松墨天牛、星天牛、云斑天牛、光肩星天牛、红棕象甲、赤拟谷盗中的一种或多种。
[0012]与现有技术相比，本专利技术具有如下优点：本专利技术所构建的粘质沙雷氏菌工程菌选择植物和鞘翅目肠道共生菌株粘质沙雷氏菌BRC
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CXG2作为毒素载体，利用接合转移技术和转座子将能够外分泌杀虫毒素蛋白的基因nptII
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cry3AaT
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hasA插入粘质沙雷氏菌BRC
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CXG2基因组中，使得外源基因nptII
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cry3AaT
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hasA能够稳定遗传。同时，利用粘质沙雷氏菌BRC
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CXG2能够在害虫肠道富集的特点，结合HasA血红素转运系统，有效将杀虫毒素从菌体内分泌到菌体外，进而使杀虫毒素富集并直接作用于肠道，从而达到杀灭鞘翅目害虫的目的。本专利技术构建的粘质沙雷氏菌工程菌能够长期在植物体内和环境中宿存，能够将毒素输送到树干中并在害虫肠道富集，且对害虫后代具有一定的毒杀效果，可对钻蛀性害虫起到良好的控制作用，为生产实践中钻蛀性害虫防治困难的问题提供了一条重要的解决途径，具有显著的技术进步性。
附图说明
[0013]图1为pCHSW质粒图谱。
[0014]图2为粘质沙雷氏菌工程菌BRC
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CXG2
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pCHSW基因组DNA及PCR产物电泳图；其中，泳道M为DNA marker，泳道1为粘质沙雷氏菌工程菌BRC
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CXG2
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pCHSW基因组DNA，泳道2为PCR产物。
[0015]图3为SDS
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PAGE和Western blotting分析Cry3AaT表达情况；其中，泳道M为蛋白 marker，泳道1为BRC
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CXG2
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pCHSW菌株胞外蛋白（SDS
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PAGE），泳道2为BRC
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CXG2
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pCHSW菌株胞内蛋白（SDS
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PAGE），泳道3为BRC
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CXG2
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pCHSW菌株胞外蛋白（Western blotting），泳道4为BRC
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CXG2
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pCHSW菌株胞内蛋白（Western blotting）。
[0016]图4为粘质沙雷氏菌工程菌BRC
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CXG2
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pCHSW对松墨天牛后代的毒杀效果。
[0017]图5为粘质沙雷氏菌在松墨天牛体内的定殖及其传代结果。
[0018]图6为粘质沙雷氏菌在松树体内的定殖迁移结果。
具体实施方式
[0019]为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。
[0020]以下实施例中所用到的材料及试剂如下：本专利技术涉及的松墨天牛、星天牛、云斑天牛、光肩星天牛、红棕象甲本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种稳定遗传外源基因的粘质沙雷氏菌工程菌BRC
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CXG2
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pCHSW，其特征在于：所述菌株的分类命名为粘质沙雷氏菌Serratia marcescens，已于2021年8月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.23125。2.根据权利要求1所述的粘质沙雷氏菌工程菌BRC
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CXG2
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pCHSW，其特征在于：所述粘质沙雷氏菌工程菌BRC
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CXG2
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pCHSW能够稳定遗传nptII
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cry3AaT
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hasA外源基因且能外分泌表达Cry3AaT蛋白。3.一种构建权利要求1所述的粘质沙雷氏菌工程菌BRC
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CXG2
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pCHSW的方法，其特征在于：所述方法为通过接合转移技术，将携带能够实现杀虫毒素蛋白外分泌表达的nptII
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cry3AaT
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hasA基因的pCHSW质粒转入到粘质沙雷氏菌BRC
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CXG2中，利用质粒上携带的tnp转座基因将外源基因nptII<...

【专利技术属性】
技术研发人员：张飞萍，吴松青，韩小红，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：