一种珊瑚共附生古菌多样性的研究方法及检测试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种珊瑚共附生古菌多样性的研究方法及检测试剂盒。本发明专利技术提供一种NestedPCR或Semi

【技术实现步骤摘要】
一种珊瑚共附生古菌多样性的研究方法及检测试剂盒

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[0001]本专利技术属于微生物分子生态学检测领域，涉及一种珊瑚共附生古菌多样性的研究方法及检测试剂盒，用于环境古菌及复杂样本如珊瑚、海绵、海葵、海藻等生物共附生古菌多样性研究。

技术介绍
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[0002]古菌作为最早的生命形式之一，广泛分布于各种环境或在生物体内共附生。古菌门类众多、多样性极其丰富，古菌在生物地球化学过程中至关重要，是地球上元素、物质和能量的重要驱动者。古菌是当前生物地球化学研究特点之一，其相关研究对阐明生命活动规律、揭示生命起源和物种进化、生物与生物或生境相互作用等具有重要意义。然而，由于古菌代谢机制和生长条件仍不完全清楚，迄今分离和纯培养的古菌种类并不多，相关研究受限制。纯培养古菌可以通过基因组、转录组、蛋白组、脂质组和代谢组等组学技术全面研究，对于非纯培养古菌DNA相关研究主要集中在宏基因组、基因文库(高通量测序文库、克隆文库等)、指纹图谱技术如变性梯度凝胶电泳(DGGE)、实时PCR(Real
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time PCR)、功能基因、原位研究和基于数据库的生物信息学分析等方面。虽然分子生物学技术的进步和大型数据库的建立为古菌研究提供了很多基础数据，但古菌研究仍存在诸多缺陷，如提取基因组DNA的质量、设计引物的局限会漏掉某些关键门类(即使是通用引物也存在片面性)，探针的特异性，PCR产物长度和区域、克隆效率等问题。
[0003]珊瑚礁是地球上生物多样性和初级生产力最高的生态系统之一，造礁石珊瑚是珊瑚礁生态系统中的“框架”生物，对于维持珊瑚礁生态系统的健康稳定以及物质循环和能量流通具有决定性作用。古菌在珊瑚礁生态系统的碳、氮及硫等生物地球化学过程中具有重要生态功能(et al.2015；Vanwonterghem and Webster,2020；Campos et al.,2022)。珊瑚共生体内，除了虫黄藻外的共附生微生物中古菌的含量因珊瑚种类而异，从1％到高达约50％(Wegley et al.,2007；Siboni et al.,2008；Blackall et al.,2015)，是珊瑚共生体的重要功能群落。目前，由于古菌研究技术限制，导致珊瑚共附生古菌研究仅少量在古菌多样性方面(Siboni et al.,2008；Bourne et al.,2016)，如克隆文库、指纹图谱、探针原位研究等，由高通量测序检测到的古菌多样性比较单一且古菌占总获得序列的含量也不高(Bourne et al.,2016；Zhou et al.,2017；Huggett and Apprill,2019)。珊瑚除了珊瑚宿主外，作为共生体还包括虫黄藻、共附生微生物如细菌、古菌、真菌、微型真核生物、病毒等，组成成分复杂且难以绝对分离，因此珊瑚总DNA包含占据主要含量的珊瑚和虫黄藻基因组DNA、及其他共附生生物的基因组DNA混合物，各类干扰较多，研究比较清晰主要是虫黄藻和细菌。
[0004]目前，古菌多样性研究主要在16S rDNA高通量测序，已报道文库构建的引物虽多但是通用性不强，无法扩增目前大型数据库(如GenBank、Silva、Greengene、RDP(ribosomal RNA data base project)等)中所有门类古菌。古菌具有特殊的性质，古菌在遗传信息传递上与真核生物相似，在代谢过程如产能等方面则与原核生物相近。因此，在复杂样本中古菌
多样性研究除了缺乏通用性强引物扩增大多数古菌外，还易受其他生物特别是真核生物基因组干扰；而常规可扩增细菌和古菌的通用引物研究珊瑚这种复杂样本最终古菌序列占比远低与细菌，无法获得真实的古菌信息。基于上述问题，需要一种特异性强且灵敏高效地检测珊瑚等复杂样本中古菌多样性的方法，以获得更高古菌覆盖率和更真实的古菌多样性信息。

技术实现思路
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[0005]本专利技术的目的是针对现有16S rDNA高通量测序研究古菌多样性存在的问题，提供了一种引物通用性强且古菌信息覆盖率高的古菌多样性研究方法及快速检测试剂盒。
[0006]本专利技术提供了以下技术方案：
[0007]本专利技术的第一个目的是提供一种快速检测古菌多样性的引物组，所述引物组包括Seq F1、Seq F2,Seq R1、Seq R2，具体如下所示：
[0008]Seq F1：5
’‑
GCMCTAYGGKGYGCASCAGK
‑3’
；如SEQ ID NO.1所示。
[0009]Seq F2：5
’‑
XXXXXXGYMGCCRCGGKAAHAS
‑3’
；
[0010]Seq R1：5
’‑
TTCGGRSCRTRCNGACCTRCCG
‑3’
；如SEQ ID NO.2所示。
[0011]Seq R2：5
’‑
XXXXXXNYRTACTYCCCARGYRG
‑3’
。
[0012]其中，简并引物代码分别是N(A,T,C,G)，M(A,C)，Y(C,T)，K(G,T)，S(G,C)，R(A,G)，W(A,T)，H(A,T,C)，B(G,T,C)。
[0013]优选，外围引物组包括上游引物Seq F1或Seq F2，下游引物Seq R1；内围引物组包括上游引物Seq F2和下游引物为Seq R2。
[0014]进一步，所述引物是通过化学合成的核苷酸片段。Index序列由6个碱基组成“XXXXXX”，用于识别各样本16S rDNA序列；同时满足以下条件：每组引物组Seq F2和Seq R2的Index序列不能相同、各组引物组Index序列可存在一端相同、各组引物组不能出现2个Index一致仅顺序不一致的情况。
[0015]本专利技术的第二个目的是提供一种珊瑚共附生古菌多样性的研究方法，提取样本基因组总DNA，以上述引物组进行PCR反应，所述PCR反应包含2轮PCR反应的Nested PCR(巢氏PCR)或Semi
‑
nested PCR(半巢氏PCR)。
[0016]优选，第一轮PCR时选取外围引物组为Seq F1和Seq R1，则第二轮Nested PCR使用内围引物组为Seq F2和Seq R2；或第一轮PCR外围引物组为Seq F2和Seq R1时第二轮Semi
‑
nested PCR使用内围引物组为Seq F2和Seq R2；由于内围引物组相同，第二轮Nest PCR和Semi
‑
nested PCR扩增产物一致。
[0017]优选，包括以下步骤：
[0018]步骤1，提取样本基因组总DNA；
[0019]步骤2，以样本基因组DNA为模板，第一轮PCR时选取外围引物组为Seq F1和Seq R1，第一轮PCR产物(稀释10～20倍)为模板进行第二轮PCR，第二轮Nested PCR使用内围引物组为Seq F2和Seq R2；或以样本基因组DNA为模板，第一轮PC本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种快速检测古菌多样性的引物组，其特征在于，所述引物组包括Seq F1、Seq F2,Seq R1、Seq R2，具体如下所示：Seq F1：5
’‑
GCMCTAYGGKGYGCASCAGK
‑3’
；Seq F2：5
’‑
XXXXXXGYMGCCRCGGKAAHAS
‑3’
；Seq R1：5
’‑
TTCGGRSCRTRCNGACCTRCCG
‑3’
；Seq R2：5
’‑
XXXXXXNYRTACTYCCCARGYRG
‑3’
。其中，简并引物代码分别是N(A,T,C,G)，M(A,C)，Y(C,T)，K(G,T)，S(G,C)，R(A,G)，W(A,T)，H(A,T,C)，B(G,T,C)。2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，外围引物组包括上游引物Seq F1或Seq F2，下游引物Seq R1；内围引物组包括上游引物Seq F2和下游引物为Seq R2。3.一种珊瑚共附生古菌多样性的研究方法，其特征在于，提取样本基因组总DNA，以权利要求1所述的引物组进行PCR反应，所述PCR反应包含2轮PCR反应的Nested PCR或Semi
‑
nested PCR。4.根据权利要求3所述的研究方法，其特征在于，第一轮PCR时选取外围引物组为Seq F1和Seq R1，则第二轮Nested PCR使用内围引物组为Seq F2和Seq R2；或第一轮PCR外围引物组为Seq F2和Seq R1时第二轮Semi
‑
nestedPCR使用内围引物组为Seq F2和Seq R2。5.根据权利要求3所述的研究方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，提取样本基因组总DNA；步骤2，以样本基因组DNA为模板，第一轮PCR时选取外围引物组为Seq F1和Seq R1，稀释10～20倍的第一轮PCR产物为模板进行第二轮PCR，第二轮Nested PCR使用内围引物组为Seq F2和Seq R2；或以样本基因组DNA为模板，第一轮PCR外围引物组为Seq F2和Seq R1，稀释10～20倍的第一轮PCR产物为模板进行第二轮Semi
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nested PCR，使用内围引物组为Seq F2和Seq R2；步骤3，第二轮PCR扩增产物切胶纯化...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭明兰，黄晖，
申请(专利权)人：中国科学院南海海洋研究所，
类型：发明
国别省市：