本发明专利技术涉及微生物鉴定技术领域，尤其涉及一种德氏乳杆菌CICC 6047菌株的鉴定方法及其引物、试剂盒和应用。本发明专利技术提出如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列在用于鉴定德氏乳杆菌CICC 6047的菌株中的应用。本发明专利技术提出德氏乳杆菌CICC 6047菌株的鉴定方法，提取待测菌株的基因组DNA，针对SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列设计引物，对基因组DNA进行扩增，比较实际扩增产物与目的扩增产物的长度，以及多态性位点碱基的情况判定德氏乳杆菌CICC 6047的菌株。本发明专利技术利用了德氏乳杆菌物种的特有保守基因序列，提出了一种简单、快速鉴定德氏乳杆菌CICC 6047菌株的方法。6047菌株的方法。
【技术实现步骤摘要】
德氏乳杆菌CICC 6047菌株的鉴定方法及其引物、试剂盒和应用
[0001]本专利技术涉及微生物鉴定
，尤其涉及一种德氏乳杆菌CICC 6047菌株的鉴定方法及其引物、试剂盒和应用。
技术介绍
[0002]德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)，是一种革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性、不运动、无芽孢、兼性厌氧、同型乳酸发酵的乳酸菌。德氏乳杆菌保加利亚亚种是工业生产发酵乳制品最常用的发酵菌种之一，在发酵过程中可将葡萄糖或乳糖转化为乳酸，降解蛋白质为小分子的肽类和氨基酸，从而提高乳制品功能性及营养价值，改善乳制品质地和风味。目前，其已被收录到我国《可用于食品的菌种名单》及欧盟QPS名单，具有食品食用安全(GRAS)状态，在全球发酵乳制品工业中具有重要的商业价值。
[0003]研究表明，蛋白分解活性、乳糖代谢能力、后酸化特性等生物活性在菌株水平具有特异性，直接影响发酵乳制品的品质和特性。因此，筛选开发具有优良性能的发酵剂菌株在乳品工业中具有非常重要的经济价值。德氏乳杆菌保加利亚亚种CICC 6047(以下简称CICC 6047)性状稳定，生物活性高，乳酸合成能力强且后酸化较弱，具有优秀的开发利用潜力。因此，快速且准确地鉴别CICC 6047菌株的方法和技术是其商业化生产的重要技术保障，对其开发利用具有重要的意义。
[0004]随着分子生物学的日益精进，细菌的分类鉴定从传统的表型特征水平分类进入到各种基因型水平分类，常用的手段有16S rRNA基因序列分析、管家基因多位点序列分析(MLST)、全基因组分析等。2006年，德氏乳杆菌保加利亚亚种模式株ATCC11842基因组完成测序工作；2016年，研究人员采用MLST技术对L.delbrueckii菌株进行了遗传多样性和种群结构分析，发现德氏乳杆菌保加利亚亚种分为六个明显的具有地域特征的谱系；NCBI GenBank数据库中已收录超过50株德氏乳杆菌保加利亚亚种的基因组数据。德氏乳杆菌保加利亚亚种不同菌株之间存在潜在的功能差异，而目前大多数常用的微生物测序手段只能将微生物鉴定到种(species)水平，因此需要针对性地设计每一株菌株的特异性引物，实现“株”水平的快速且精准的鉴定。
技术实现思路
[0005]为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种简单、快速鉴定德氏乳杆菌CICC 6047菌株的方法及其引物、试剂盒和应用。
[0006]本专利技术提出如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列在用于鉴定德氏乳杆菌CICC 6047的菌株中的应用。
[0007]可选的，SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列上的第225位、第298位的碱基为多态性位点。
[0008]本专利技术提出一种德氏乳杆菌CICC 6047菌株的鉴定方法，至少包括以下步骤：
[0009]S1、提取待测菌株的基因组DNA；
[0010]S2、针对SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列设计引物，引物的目的扩增产物覆盖至少一个SEQ ID NO:1的多态性位点；
[0011]S3、利用引物对基因组DNA进行扩增，获得实际扩增产物；
[0012]S4、如实际扩增产物与目的扩增产物的长度不一致，则待测菌株鉴定为非德氏乳杆菌CICC 6047；
[0013]S5、如实际扩增产物与目的扩增产物的长度一致，对实际扩增产物进行测序，并与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列进行对比：
[0014]如实际扩增产物多态性位点的碱基与SEQ ID NO:1相同，待测菌株鉴定为德氏乳杆菌CICC 6047；
[0015]如实际扩增产物多态性位点的碱基与SEQ ID NO:1不同，待测菌株鉴定为非德氏乳杆菌CICC 6047。
[0016]可选的，德氏乳杆菌CICC 6047菌株的鉴定方法至少包括以下步骤：
[0017]S1、提取待测菌株的基因组DNA；
[0018]S2、针对SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列设计引物，引物的目的扩增产物至少覆盖SEQ ID NO:1的第225位～第298位的碱基；目的扩增产物的长度为74bp～984bp；
[0019]S3、利用引物对基因组DNA进行扩增，获得实际扩增产物；
[0020]S4、如实际扩增产物与目的扩增产物的长度不一致，则待测菌株鉴定为非德氏乳杆菌CICC 6047；
[0021]S5、如实际扩增产物与目的扩增产物的长度一致，对实际扩增产物进行测序，并与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列进行对比：
[0022]如实际扩增产物在SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的对应位置上第225位的碱基为T且第298位的碱基为A，待测菌株鉴定为德氏乳杆菌CICC 6047；
[0023]如实际扩增产物在SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的对应位置上第225位的碱基不为T或第298位的碱基不为A，待测菌株鉴定为非德氏乳杆菌CICC6047。
[0024]可选的，在S2中，目的扩增产物的长度为100bp～300bp。
[0025]可选的，在S2中，引物的目的扩增产物至少覆盖SEQ ID NO:1的第189位～第366位的碱基。
[0026]可选的，引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。
[0027]本专利技术提出一种于鉴定德氏乳杆菌CICC 6047菌株的试剂盒，应用SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列进行菌株鉴定，包括采用PCR技术和基因测序技术检测SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列上的多态性位点。
[0028]可选的，试剂盒内包括核酸扩增试剂，核酸扩增试剂内至少含有如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列的引物对。
[0029]本专利技术提出一种用于鉴定德氏乳杆菌CICC 6047菌株的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示。
[0030]本专利技术实施例提供的技术方案与现有技术相比具有如下优点：
[0031]本专利技术利用了德氏乳杆菌物种的特有保守基因序列，提出了一种简单、快速鉴定
德氏乳杆菌CICC 6047菌株的方法。
[0032]在优选的技术方案中，本专利技术的引物对在德氏乳杆菌“种”水平上特异性良好且在“株”水平上可以精准快速鉴定CICC 6047菌株。
附图说明
[0033]图1是保守基因6047_14_37与33个NCBI库中近缘序列构建的进化发育树；
[0034]图2是5对引物对的特异性扩增验证电泳图；1为SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3引物对，2为SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5引物对，3为SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7引物对，4为SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9引物对，5为SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11引物对，6为空白；本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列在用于鉴定德氏乳杆菌CICC 6047的菌株中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列上的第225位、第298位的碱基为多态性位点。3.一种德氏乳杆菌CICC 6047菌株的鉴定方法，其特征在于，至少包括以下步骤：S1、提取待测菌株的基因组DNA；S2、针对SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列设计引物，所述引物的目的扩增产物覆盖至少一个SEQ ID NO:1的多态性位点；S3、利用所述引物对所述基因组DNA进行扩增，获得实际扩增产物；S4、如所述实际扩增产物与所述目的扩增产物的长度不一致，则所述待测菌株鉴定为非德氏乳杆菌CICC 6047；S5、如所述实际扩增产物与所述目的扩增产物的长度一致，对所述实际扩增产物进行测序，并与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列进行对比：如所述实际扩增产物多态性位点的碱基与SEQ ID NO:1相同，所述待测菌株鉴定为德氏乳杆菌CICC 6047；如所述实际扩增产物多态性位点的碱基与SEQ ID NO:1不同，所述待测菌株鉴定为非德氏乳杆菌CICC 6047。4.根据权利要求3所述的鉴定方法，其特征在于，至少包括以下步骤：S1、提取待测菌株的基因组DNA；S2、针对SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列设计引物，所述引物的目的扩增产物至少覆盖所述SEQ ID NO:1的第225位～第298位的碱基；所述目的扩增产物的长度为74bp～984bp；S3、利用所述引物对所述基因组DNA进行扩增，获得实际扩增产物；S4、如所述实际扩增产物与所述目的扩增产物的长度不一致，则所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：姚粟，宋智泉，葛媛媛，于学健，刘蕊，程坤，郭立峥，
申请(专利权)人：中国食品发酵工业研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：
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